PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositides 총 막 지질의 일부에 기여하지만, 셀룰러 다양한 공정에서 중요한 역할을한다. 그들은 제 3의 이노시톨 반지의 가역적 인산화 또는 탈 인산화에서 파생 된 일곱 멤버, 4 번째와 5 번째 위치 (1)을 포함한다. 포스파티딜 이노시톨 4 포스페이트 (PI4P) 및 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)는 세포 원형질막 (PM)의 2,3- 행렬식 지질 비교적 독립적으로 기능 두 가지 phosphoinositides이다. 포스파티딜 이노시톨 (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) 훨씬 덜 풍부한 PI4P 및 PI (4,5) P 2 이상이지만, 암 (4)과 당뇨병 (5) 등 다양한 세포 과정에 고유 한 기능을 가지고있다. 이러한 지질는 이펙터 및 다른 많은 단백질과 복잡한 분자 상호 작용을 가지고있다. 따라서, 이러한 포의 공간적 구성을 이해하기 위해 중요나노 미터 스케일에서 오후에 sphoinositides.
장착 증거는 제한 PM 분야에서 단백질 복합체 또는 분자 클러스터가 핫스팟 (6) 신호 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, 신택의 1A, 막 융합 7-9를 조절하는 중요한 단백질은 오후에 클러스터 조직을 표시합니다. 신택 (1a)의 클러스터 조직의 합의 뷰에서 고유의 오후에 phosphoinositides의 공간 분포는 논쟁의 여지가있다. PI (4,5) P 2 분포 패턴을 사용하는 클러스터 14-18, 세포 유형에 따라 실험 방법을 조밀하기 위해, 균일 10-12, 큰 패치 13, 14 이르기까지 다양합니다. 높은 해상도에서 PI (4,5) P (2)의 공간 조직은 일치하지 않습니다. 자극 방출-고갈을 사용하는 연구는 (STED) 현미경 (19)는 조밀 한 PI (4,5) P (2) 나노 클러스터의 큰 숫자를 공개했다 (~ 직경 73 nm의) PC-12 세포 (20)의 PM 시트에 </s>입니다. 이러한 결과는 신속한 동결 전자 현미경 (EM) 21, 22, 화학적 고정화보다 훨씬 생균의 손상 PM 구조를 유지 접근법을 사용하는 연구와 다르다. 후자는 PI (4,5) P (2)의 별개의 풀을 보여 주었다; 상대적으로 집중 PI (4,5) 카베 올래 및 코팅 된 구덩이에서 P 2뿐만 아니라 평면 PM 영역에 균일 한 분포. 또한, 멤브레인 시트에 나노 PI (4,5) P (2) 조직은 라이브와 고정 된 세포에서 다를 수 있습니다. 우리의 최근의 연구는 단일 분자 현지화 현미경 (SMLM) (23)를 사용하여 두 고정 사는 INS-1 세포에서이 문제를 조사 하였다.
SMLM 개별 형광이 높은 정밀도로 현지화 될 수 있도록 확률 적 주어진 시간에 형광의 작은 하위 집합에 전환을 기반으로합니다. 많은 초해 촬상 방법은 종래의 광학 현미경의 회절 한계를 능가하는 유사한 원리를 사용하여 개발되었다 이러한님의 photoactivation 현지화 현미경 (PALM) (24), 형광 photoactivation 현지화 현미경 (FPALM) (25), 확률 적 광 재건 현미경 (STORM) 26, 27 및 직접 STORM (dSTORM) 28. 사진 전환 또는 광활성 형광 물질 (염료 또는 형광 단백질)로, SMLM 기술은 살아있는 세포 (31, 32)에 비디오 속도 나노 미터 해상도 24,29,30에서 이미지 생물학적 구조에 과학자를 할 수 있습니다.
예를 들어 PI (4,5) P 2를 사용하여, 우리는 오후에 phosphoinositides의 나노 크기의 분포를 연구하기 SMLM 방식을 도입했다. 특히 PI에 결합 PLCδ1 (포스 C의 δ1)의 PH 도메인 (4,5) P 2는 오후에 영상 PI (4,5) P (2) 하위 세포 분포 및 역학 33, 34에 대한 잘 확립 된 프로브입니다 . 우리는 유 전적으로 두 형광 단백질, PAmCherry1 35 IRFP (36)이 도메인을 태그 한 </SUP> 이중 색상 융합 단백질 (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1)를 생성하기 위하여 (도 1A-B는). PAmCherry1 손바닥위한 PH 도메인의 광활성 프로브로서 기능하고 IRFP는 PALM 취득 전에 형질 감염된 세포를 식별하는 일반적인 지표 역할 . 우리는 고정 된 멤브레인 시트에 SMLM 영상이 듀얼 컬러 형광 프로브를 적용합니다. 라이브 PALM 촬상을 위해, 우리는 더 나은 광자 효율 및 휘도 (도 1C-D)에 대한 mEOS3.1-PH의 PLCδ1 프로브를 생성 PH의 PLCδ1 도메인 mEOS3 37 대신 PAmCherry1 태그.
인슐린 분비 INS-1 세포 (38)의 PM 이러한 새로운 프로브 SMLM 영상은 PI (4,5)에 오후 지역의 대부분에서 P 2뿐만 아니라 진한 PI (4,5) P (2)의 균일 한 라벨을 발견했다 드문 드문 평면 오후 일부 filopodia 같은 구조 (23)에 혼합되어 마이크로 도메인. 개구PI (4,5) P (2)의 noScale로 분포는 살아있는 세포에서 기능하는 방법을 다시 생각하기위한 구조적 기반을 제공합니다.
멤브레인 시트 생산 및 샘플 고정 : 문제 해결을 위해이 프로세스는 특별한주의가 필요합니다. 프로토콜에 기재된 바와 같이, 단계 1.1.6의 커버 슬립의 배양 시간은 막 시트 생산을 위해 중요하다. 우리의 실험 조건에서 최적의 배양 시간은 7-10 분 (그림 2)입니다. 10 분 배양 이상은 작거나 PDL 코팅 된 커버에 아무런 멤브레인 시트로 이어질 것 대신 PDL의 커버 슬립 짧은 배양에 막 시트의 손상 세포를 생성합니다. 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 고정시 고정 제와 온도는 PM의 PI (4,5) P (2) 분포를 유지하기 위해 중요합니다. RT에서 고정 또는 단독 4 % -PFA의 사용은 PM의 정상 지질 분포를 왜곡 할 수있다.
지질 연구를 막 PALM 현미경을 적용하여, 우리는 (4,5) P (2), m을 매개 키 포스 PI의 나노 미터 크기의 분포를 관찰 할 수있다근본적인 세포 활동. INS-1 세포에서의 제한 농도 구배와 PI (4,5) P (2)이 공간적 분포는 지질 단백질 상호 작용 및 PI 이러한 세포에서 (4,5) P (2) 지역 신호 이벤트를 다시 생각하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 더욱이, 본 연구에서 개발 된 방법은 또한 생물학적 과정에서 phosphoinositides을 연구하는 새로운 도구를 제공함으로써, 적절한 프로브 다른 막 인지질 연구에 적용될 수있다.
세제 처리 및 세포질에서 잠재적 인 신호 오염이 작품에 막 시트의 사용은 인지질 형태 학적 연구에서 두 가지 주요 문제를 무시합니다. 세제는 종종 클러스터링 및 오후 인지질 신호의 상당한 손실을 야기한다. 세포질 신호의 오염은 PI (3,4,5) P (3) 및 PI (3,4) P (2)와 PM (23)에 둘러 풍부한 phosphoinositides의 경우에 특히 문제가된다. 멤브레인 시트 샘플은 새로운 Circu 할 수 있습니다그러한 상당히 피질 액틴 그물 세공 및 클라 코팅 피트 42,43 아니라 세포막과 연결된 구조를 방해하지 않고 이러한 문제를 mvent. 된 PM의 PI (4,5) P (2)의 상대적으로 균일 한 분포가 섬유 아세포 성 멤브레인 (44)에 GST-PH PLC δ1의 프로브를 사용하여 다른 빠른 냉동 EM 연구와 잘 일치한다.
이 부적절한 시료 처리 조건이 잘못된 결과를 생성 할 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 첫째, 저온 (4 ℃)에서 고정 단계를 수행하고, 막 시트의 생산을위한 정착액 GA를 사용하는 것이 중요하다. 도 3에 도시 된 바와 같이, GA없는 따뜻한 온도 PFA 고정 셀의 PM phosphoinositides를 해결하기에 충분하지 않다. 이 그대로 PI (4,5) P (2) 분포를 왜곡하고 생리 학적 조건에서 살아있는 세포에서 관찰되지 않는 날카로운 클러스터를 생성 할 수 있습니다. 둘째, PAmCherry1 사용로서SMLM 프로브는, 오히려 다른 프로브보다 양적 PALM 이미징을위한 중요한 것입니다. PAmCherry1 응용 프로그램의 장점은 밝기, 높은 광 활성화 효율성과 무엇보다도, 매우 제한된 사진 – 깜박이는 등의 잘 특성화 단일 분자 광 물리적 특성 35,40,45에서 온다. 이러한 속성은 사진 깜박 잠재적 클러스터 아티팩트를 제거하고 정량적으로 막 PI (4,5) P (2)의 분자 밀도를 분석 할 수있게.
이러한 접근 방식은 또한 한계가있다. 셀 촬상 전에 중단되기 때문에 먼저, 본 연구에 사용 된 멤브레인 시트 법 완전히 PI (4,5) P (2)의 생체 분포를 흉내낼 수있다. 그러나, 우리의 라이브 PALM 영상은 멤브레인 시트 샘플 관찰 결과를 지원하는 PI (4,5) P (2)의 유사 상대적으로 균일 한 분포를 보여줍니다. 우리는 우리의 이전 작업 (23)에 설명 된대로 둘째, SMLM 이미징 전문 지식과 추가로 필요합니다의 장력은 사용 된 프로브, 샘플 준비 및 고정, 이미지 샘플링 및 재구성 등 다양한 공정에서 발생할 수있는 이미지 아티팩트를 방지 할 수 있습니다. 산도 도메인 기반 프로브 및 항체 널리 포스 공부 (46, 47)에 사용되어 왔지만 마지막으로, 상기 멤브레인의 모든 PI (4,5) P (2)는이 방법에 의해 검출 될 수있는 가능성이 남아있다. 예를 들어, 다른 내인성 단백질에 의해 구속 PI (4,5) P (2) PH 프로브 또는 항체에 액세스 할 수 없습니다 수 있으며,이 때문에 자신을 프로브의 공간 방해에 PI (4,5) P (2)의 과소 평가의 원인이 될 수 있습니다. 라벨 PI (4,5) P (2) 다른 방법은 원래의 꼬리에 수정과 정상 플 루어 PI (4,5) P 2 (48), 미리 라벨링 PI (4,5) P (2) 아날로그를 사용하는 것 PI (4,5) P (2). 그 이노시톨 링 endogenou와 동일하기 때문에, 그것은 빠르게 생균 대사에 의하여 다른 포스 아형으로 빠르게 변환 될 수있다님의 PI (4,5) P (2). 이것은 살아있는 세포에서이 미리 라벨링 PI (4,5) P (2) 아날로그 충실 PI (4,5) P (2)보다는 대사 제품을 대표 할 수 있는지 우려를 제기한다. 따라서, 일부 제한에도 불구하고, PH 도메인 기반 프로브 널리 세포의 PM에 PI (4,5) P (2) 분포와 역학을 모니터하기 위해 사용 된 가장 프로브 중 계속된다.
이 방법론의 미래 애플리케이션은 PI (3,4,5) P (3) 및 PI (3,4) P (2)와 같은 다른 포스 연구로 확장 될 수있다. 요약하면, 여기에 사용되는 새로운 SMLM 접근 방식은 세포에서 포스를 연구 할 수있는 새로운 방법을 엽니 다. 예를 들어 PI (4,5) P (2)를 사용하여, 우리는 고유 세포막 분자의 형태 및 정량 연구 PALM 영상의 특성뿐만 아니라, 그 단점을 보여준다. 이 방법은 관심의 다른 분자에 적용 할 수 있으며, 세포 생물학의 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |