新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

1.メンブレンシートの準備と固定 iRFP-PAmCherry1-PH のPLCδ1で標識された膜シートを準備します DNAをコードするプラスミドiRFP-PAmCherry1-PH PLCは 、標準的な分子生物学的技術を使用して23を δ1準備します。 標準INS-1細胞培養プロトコルに従って50から70までパーセントの密集度に30 / mlのフィブロネクチン38,39でプレコーティング＃1.5 18ミリメートルラウンドのカバースリップ上の培養INS-1細胞。 50〜70％の集密度に達した後、細胞を一日にトランスフェクト。 製造者のプロトコルに従ってリポソームトランスフェクション試薬を使用してδ1iRFP-PAmCherry1-PH PLCで細胞をトランスフェクトします。トランスフェクション後、細胞を48時間成長させます。 実験の日に、〜0.5とコートカバースリップ（1-側） – 500 / mlのポリ-D-リジンの1ミリリットル、1〜2時間（PDLは、DH 2 Oで希釈します）。その後にティッシュペーパーを配置することによって、PDLドレインカバーガラスの縁。後で使用するために予備冷却（4℃）金属板にカバースリップを置きます。 1mMのEGTAを含有する1 mlの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS） – 事前トランスフェクトINS-1細胞は、〜0.5でカバーガラス上で成長洗います。洗浄を3回繰り返し、PBSを排出。 ピンセットであらかじめ冷却金属板上のPDLコートしたカバーガラス上で培養した細胞（下を向いセル側）にカバースリップを置きます。細胞はPDLコートしたカバースリップ（ 図2）にアタッチできるようにするために10分- 7冷蔵庫（4℃）でプレートを残します。 注： – PDLでコーティングされた表面への細胞のより良好な付着のために10分のインキュベーション時間は、7の範囲であるべきです。冷蔵庫の環境が乾燥しているとのインキュベーションが長すぎてはなりません。 冷蔵庫から金属プレートを取り外します。静かにピンセットを使用して、事前にトランスフェクトした細胞を含むカバースリップを剥がします。これは、上の細胞膜シートの薄い層を生成しますPDLコートしたカバースリップ。穏やか〜0.5で膜シート洗浄1 – mlの氷冷PBSを、次いで〜0.5で固定 – 4℃で15分間、PBS中の1 mlの氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）+ 0.2％グルタルアルデヒド（GA）。 注意：パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは毒性があります。皮膚や眼の保護とヒュームフードでそれらを扱います。 固定後、画像膜シートはすぐに（セクション3を参照）、または〜0.5で保存する – 4℃で1 mlのPBSを。 注：メンブレンシートを固定した後、細胞質ゾルからのPI（4,5）P 2にPHプローブの結合は全く均衡は存在しません。 （それは数日から数週間かかるかもしれませんが）に結合したPHプローブは徐々に膜シートから解離し、溶液中に拡散します。したがって、それは右の試料調製後の画像に固定されたサンプルをお勧めします。 PI（4,5）P 2特異的抗体標識に膜シートを準備 ＃1.5上での培養INS-1細胞、30＆でプレコーティング18ミリメートルラウンドカバースリップ＃181; 50％-70％のコンフルエンスまでグラム/ mlのフィブロネクチン。ステップ1.1.3で説明したようにDNAによるトランスフェクト細胞は翌日プラスミド。 上記のように1.1.4から1.1.7までの手順を繰り返します。 注：4°Cで次の手順を実行します。 50mMのNH 4 Cl を含有1ミリリットルの氷冷PBS – 〜0.5で固定PMシートを含むカバースリップを3回洗浄します。 〜0.5でシートをクエンチ- 7分間、PBS中の1ミリリットルの0.1％の水素化ホウ素ナトリウム、および〜0.5で洗浄- （50mMのNH 4 Cl をせずに）1ミリリットルPBS。 ブロッキング溶液1 mlの45分間（5％（v / v）の正常ヤギ血清、5％（v / v）のウシ血清アルブミンおよび50mMのNH 4 Cl を含有PBS溶液） – 〜0.5を有する試料をブロックします。 1時間ブロッキング溶液中で：（300倍希釈）1ミリリットルのプライマリPI（4,5）P 2抗体-そして、〜0.5でインキュベートします。 50mMのNH 4 Cl を含有1mlのPBS – 〜0.5で3回（10分毎に）洗浄します。 1ミリリットル二のF（ab '）2ヤギ抗マウス – 〜0.5でサンプルをインキュベート1時間ブロッキングバッファー中：蛍光団（300 1）とコンジュゲートした抗体。 1mlのPBS – 〜0.5で3回洗浄します。 ポストフィックスサンプルを4％PFA + 0.2％GAで15分間、その後PBS（7分毎に）で試料を3回洗浄します。イメージングのために、セクション3に進んで以降の使用のために4℃で〜0.5〜1mlのPBSを中に格納します。 注：4°Cでサンプルを準備します。 PM中のホスホイノシチドの生理的な分布を維持するために、4％PFA + 0.2％GAの固定剤を使用してください。一人で4％PFAを用いたRTの準備または固定は重要な成果物（ 図4）を引き起こす可能性があります。 mEOS3.1-PH PLCδ1とのライブセルイメージング用2.細胞培養の準備以前23記載されているようmEOS3.1-PH のPLCδ1 をコードするDNAプラスミドを準備します。 30 / mlのフィブロネクチンでプレコート＃1.5 18ミリメートルラウンドカバースリップ上で培養INS-1細胞を、彼らは50％-70％のconflに達するまで標準INS-1細胞培養プロトコル38,39次uency。 次の日は、製造者のプロトコルに従って、リポソームトランスフェクション試薬を用いてmEOS3.1-PH PLCδ1DNAプラスミドとINS-1細胞をトランスフェクション。撮影前に48時間インキュベートします。 メンブレンシートと生細胞の3 PALM画像取得膜シートのPALM画像取得注記：ここでは、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡ベースSMLMシステム（100X油、APO、NA = 1.49、WD 0.12 mm）を23全ての画像取得のために使用されます。 撮影前に、10mlのPBS + 50のMgCl 2に蛍光ビーズ溶液1μlを希釈。 10分間（ステップ1.1.8 / 1.2.6から）細胞試料を含む画像化チャンバへの溶液を希釈した200μlのを追加します。その後、PBSで3回洗浄します。 PALMイメージングシステムを起動します。関連するイメージングソフトウェアでは、「iRFPチャンネルを選択＆＃34;ボタン（642 nmのレーザー励起、75分の700 nmの発光）。 iRFPチャネルでPHプローブを発現する細胞膜を検索します。 注：メンブレンシートは、近くの蛍光ビーズを持っている必要があります。これは、後にドリフト補正のために必要とされます。 将来の画像再構成のための基準としてiRFPチャネルにおける細胞膜の従来のTIRF画像を収集するために、「取得」ボタンを使用します。イメージングの設定TIRF角度に2140を入力して（ すなわち 、臨界角に達した後、さらに1.5度回転）、通常の全反射角を設定します。特に断りのない限り、すべてのステップの設定この角度を使用してください。 注：ここで説明するTIRFシステムにおいて、3500は最大垂直角度であり、2200はTIRF臨界角であり、2140年はTIRF臨界角後より1.5度である通常のTIRF角、です。 3.2.3で下記の狭いTIRF角がTIRF臨界角に達した後に、別の2度である、2120年です。 目をクリックしてPAmCherry1チャンネルに切り替え電子RFPのチャンネルボタン（561 nm励起、50分の600 nmの発光フィルター）。背景膜蛍光を漂白するために10から20秒間、561 nmレーザーのフルパワー照明を持つように右に「AOTF」パッド内のすべての方法を、スクロールバーを調整します。 「フォーマット」タブと「ND系列の取得」タブの高速取得プロトコルに最適なカメラの設定（2×2ビニング）を設定します（通常は20 Hzで10,000-40,000画像）。 「今すぐ実行」ボタンをクリックして – 低レベル（1％、0.1％）で同時405 nmのレーザー活性化とPAmCherry1画像（フルパワーで561 nmレーザー、50ミリ秒/フレーム）の取得を開始します。各フレーム内の空間的に分離された個々の点ように405 nmのレーザーの強度を調整し、容易に識別可能です。 注：活性化PAmCherry1分子の数は、取得中に徐々に減少します。 405 nmのレーザー強度は徐々にそれぞれの個々の分子信号の最適な濃度を維持するために増加されるべきですフレーム。 何PAmCherry1単一分子信号が活性化されなくなるまで画像を取得続けます。 生きた細胞中のPALMイメージングステップ3.1.1で説明したように、撮像前に、10分間の撮像チャンバ内に蛍光ビーズを希釈します。そして、関連したイメージングソフトウェアを開いてPALM撮影を開始します。 注：生細胞イメージングのための磁気クイックリリース撮像チャンバを使用します。細胞外バッファー（細胞外溶液と一定灌流下の温度コントローラーを35℃での撮像領域の中心を維持：135のNaCl、5.6のKCl、2.6 mMのCaCl 2を、1.2のMgCl 2、3 mMグルコース、および20mM HEPES; pH値= 7.3）。 GFPのチャンネルボタン（50分の525 nmの発光）を選択します。 488nmのレーザー励起下mEOS3からの緑色蛍光に基づいて蛍光プローブを発現する細胞膜を特定します。これはオフラインDRIのために、後に必要とされるような蛍光ビーズが近くの撮像中にも含まれていることを確認しますフィート補正。 参照画像としてmEOS3（緑）チャネルにおける細胞膜のTIRF画像を収集するために、「取得」ボタンをクリックします。ライブセルイメージングの設定TIRF角度に2120を入力して（臨界角に達した後、別の2度回転）浅いエバネッセント波励起照明を使用してください。 注：これは、原形質膜に隣接する細胞質ゾル中の非結合mEos3-PHからの蛍光を最小限に抑えることができます。 「RFPチャネル」ボタン（561 nm励起、50分の600 nmの発光）に切り替えます。 （3.1.4を参照）、「AOTFパッド」で、スクロールバーを持つ10〜20秒間膜シートのバックグラウンド蛍光を漂白するためにフルパワー561 nmのレーザーを使用してください。 同時405 nmのレーザー活性化（「カメラ」設定タブで10ミリ秒/フレームに設定さ561 nmのフルパワー、）赤チャンネルで「今すぐ実行」ボタンをクリックすることで、画像取得を開始します。空間的に分離されたポイントを有効にするには405 nmのレーザー強度を調整します各フレームインチ注：買収が進行し、未変換mEOS3.1-PH PLCδ1として分子の数は緩やかに減少します。徐々に単一分子信号を最適化するために、405nmのレーザパワーを増大させます。画像取得の長さは、実験の目的によって異なります。通常の条件下で5分間連続して画像を取得します。より長い取得が必要な場合、代わりに単一の大きな画像スタックの複数の画像スタックを収集します。各画像スタックのファイルサイズが4ギガバイトを超えてはならないか、それは以降のソフトウェアの分析に影響を与えます。 4. SMLM画像処理と復興イメージ分析ステーションに画像ファイル（.TIF画像スタック）を転送します。前述のように37 MATLABで画像再構成プログラム（カスタム書かれた）を起動し、その後、その後、「新しいファイル」「開く」、メインメニューの「ファイル」タブをクリックすることで、画像スタックをロードします。 特定し、ロカ各フレームから個々の分子のイベントを平安大町。 「ウェーブレット」のしきい値数（1-10）で強度閾値をフィルタリング設定します。視覚的に再構築する前に、ポイント検出のための最適なパラメータ設定を確認します。そして、「PALM」タブに移動し、画像再構成を開始するには、「1段階プロセス」をクリックします。 注：ポイント検出のための強度閾値は任意であり、個人的な経験に依存します。いくつかの試験はどちらがあまりにも多くの修飾されていない（dim）はポイントをピックアップすることも、あまりにも多くの修飾（明）ポイントをフィルタリングすることを最適な検出閾値を生成するために必要とすることができます。データ分析を最適化するために他のパラメータを調整します。ここでは、近傍距離（結合された距離内で隣接するフレーム内の蛍光点）が65 nmの（1/2ピクセル幅）として設定し、単一分子として装着されています。ギャップフレーム（これらのフレームと近傍距離内で発生した個々の分子のイベントは、単一分子イベントとして組み合わされ、適合させた）であり、PAmCherry1画像40用の26フレーム（1.3秒）として設定します。 SMLMで40を数えるオーバーを避けるために単一分子プローブ及び取得レートの特性に応じてこれらのパラメータを調整します。再建中の蛍光ビーズでドリフト補正を適用します。 iRFP-PAmCherry1-PH のPLCδ1によって標識固定膜シートを画像化するために、シングル超解像37に同じ膜シートから全体画像スタックを再構築します。 1000個の連続フレームスタックはの時間分解能を有する単一の超解像画像として再構築されるようにmEOS3.1-PH のPLCδ1によって標識された生細胞のサンプルについて1000フレームのいくつかの小さなスタックに画像全体のスタックを分離します10秒。最後に、最終的な時系列スタック23内のすべての時系列画像を組み合わせます。 注：生細胞PALMイメージングでは、活性化プローブの数が少ない移動または解離することができます漂白前のPMにおけるPI（4,5）P 2から。プローブのオーバーサンプリングを説明するために、画像解析時に単一の発光イベントに（代わりに65nmの）130nmの範囲内の隣接フレーム内の個々の分子の信号を合成します。 再構成画像を取得した後、ペア相関41を有する分子密度、マイクロドメインの密度/サイズ、およびクラスタ分析を定量化するためのMatlabでカスタム作成のプログラムとのさらなる画像分析を行います。