PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositiden tragen zu einem geringen Teil der gesamten Membranlipiden, sondern in einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. Sie umfassen sieben Mitglieder abgeleitet von reversible Phosphorylierung oder Dephosphorylierung des inositol Ringe auf der 3., 4. und 5. Positionen 1. Phosphatidylinositol – 4-phosphat (PI4P) und Phosphatidylinositol – 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) sind zwei wichtige Phosphoinositiden , die relativ unabhängig wie die Determinante Lipide der Zellplasmamembran (PM) 2,3 funktionieren. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) viel weniger reichlich als PI4P und PI (4,5) P 2, aber es hat einzigartige Funktionen in verschiedenen zellulären Prozessen , einschließlich Krebs und Diabetes 4 5. Diese Lipide haben komplexe molekulare Interaktionen mit ihren Effektoren und viele andere Proteine. Daher ist es entscheidend, die räumliche Organisation dieser pho zu verstehensphoinositides im PM auf der Nanometer-Skala.
Montage Beweise hat gezeigt , dass Proteinkomplexe oder Molekülcluster in den engen PM Bereichen als Signal Hotspots 6 dienen kann. Zum Beispiel Syntaxin 1a, ein Schlüsselprotein , das die Membranfusion 7-9, zeigt Cluster – Organisation in der PM reguliert. Unterscheidet sich von der Konsensusansicht der Clusterorganisation von Syntaxin 1a, die räumliche Verteilung von Phosphoinositiden in der PM ist umstritten. PI (4,5) P 2 Verteilungsmuster reichen von Uniform 10-12, große Flecken 13,14, zu dichten Büscheln 14-18, je nach Zelltypen und experimentelle Methoden verwendet. Die räumliche Organisation von PI (4,5) P 2 mit höherer Auflösung ist auch widersprüchlich. Eine Studie unter Verwendung von stimulierten Emission-Depletion (STED) Mikroskopie 19 hat eine große Anzahl von dicht PI (4,5) P 2 Nanocluster (~ 73 nm Durchmesser) in den PM Blätter PC-12 – Zellen 20 ergab </sup>. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von Studien unter Verwendung von Schnellfroster Elektronenmikroskopie (EM) 21,22, ein Ansatz, der die intakte PM Struktur von lebenden Zellen viel besser als chemische Fixierung bewahrt. Diese zeigten einen deutlichen Pools von PI (4,5) P 2; relativ konzentrierten PI (4,5) P 2 in Caveolae und beschichtet sowie eine gleichmäßige Verteilung auf der flachen Region PM Pits. Darüber hinaus nanoskaligen PI (4,5) P 2 Organisation in Membranfolien können in lebenden und fixierten Zellen unterscheiden. Unsere jüngsten Arbeiten untersucht dieses Problem in stationären und leben INS-1 – Zellen Einzelmolekül – Lokalisationsmikroskopie (SMLM) 23 verwendet wird .
SMLM basiert auf stochastisch Einschalten nur eine kleine Teilmenge von Fluorophoren zu einem bestimmten Zeitpunkt, so dass einzelne Fluorophore mit hoher Genauigkeit lokalisiert werden. Viele Super-Resolution Imaging-Ansätze wurden unter Verwendung ähnlicher Prinzipien entwickelt, um die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie zu überwinden, wie eins Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM) 24, Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisationsmikroskopie (FPALM) 25, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) 26,27 und direkte STORM (dSTORM) 28. Mit photoschaltbare oder photoaktivierbaren Fluorophore (Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine), erlauben SMLM Techniken Wissenschaftler Bild biologischen Strukturen in Nanometer – Auflösung 24,29,30 mit Video-Rate in lebenden Zellen 31,32.
Mit PI (4,5) P 2 als Beispiel, haben wir das SMLM Ansatz die nanoskalige Verteilung von Phosphoinositid auf dem PM zu studieren. Die PH – Domäne von PLCδ1 (Phospholipase C δ1) , die PI bindet spezifisch an (4,5) P 2 eine gut etablierte Sonde zur Bildgebung PI (4,5) P 2 subzelluläre Verteilung und Dynamik 33,34 in der PM . Wir haben genetisch diese Domäne mit zwei fluoreszierenden Proteinen markiert, PAmCherry1 35 und 36 iRFP </sup> , um eine Zweifarben – Fusionsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (1A-B). PAmCherry1 dient als photoaktivierbare Sonde von PH – Domäne für PALM und iRFP dient als allgemeiner Indikator zu transfizierten Zellen zu identifizieren , bevor PALM Erwerb . Wir wenden diese zweifarbige Fluoreszenzsonde für SMLM Bildgebung in den festen Membranfolien. Für Live – PALM – Bildgebung, getaggt wir mEOS3 37 anstelle von PAmCherry1 an die PH PLCδ1 Domäne der mEOS3.1-PH PLCδ1 Sonde für seine bessere Photoneneffizienz und Helligkeit (1C-D) zu erzeugen.
SMLM Bildgebung mit dieser neuartigen Sonden in der PM von insulinsezernierenden INS-1 – Zellen 38 hat homogene Markierung von PI (4,5) P 2 in der Mehrzahl der PM Regionen sowie konzentrierte PI (4,5) P 2 freigelegt Mikrodomänen , die in der Wohnung PM und einige Filopodien artige Strukturen 23 dünn miteinander vermischt werden. Dann einnoScale Verteilung von PI (4,5) P 2 eine strukturelle Basis für ein Umdenken , wie es funktioniert in lebenden Zellen.
Zur Fehlersuche, müssen zwei Prozesse besondere Aufmerksamkeit: Membranfolie Produktion und Probenfixierung. Wie in dem Protokoll beschrieben, ist die Inkubationszeit von den Deckgläsern in Schritt 1.1.6 wichtig für die Membranfolie Produktion. Optimale Inkubationszeit unter unseren experimentellen Bedingungen ist 7-10 min (Abbildung 2). Länger als 10 Minuten Inkubation werden intakte Zellen produzieren anstelle der Membranblätter auf PDL Deck und kürzere Inkubation wird weniger oder kein Membranblätter auf den PDL-beschichtete Deckgläser führen. Wie in dem Protokoll beschrieben, sind die Fixiermittel und Temperatur während der Fixierung der kritischen PI (4,5) P 2 -Verteilung im PM aufrechtzuerhalten. Die Fixierung bei RT oder die Verwendung von 4% -PFA allein könnte die normale Lipidverteilung in der PM verzerren.
Durch die Anwendung PALM – Mikroskopie Lipidforschung an der Membran, sind wir in der Lage , die Nanometer – Skala Verteilung von PI (4,5) P2, ein Schlüssel Phosphoinositid , die m vermittelt zu beobachtenalle grundlegenden zellulären Aktivitäten. Diese räumliche Verteilung von PI (4,5) P2 mit begrenzter Konzentrationsgradienten in INS-1 – Zellen bietet einen Rahmen Lipid-Protein – Wechselwirkungen und lokale Signalereignisse von PI (4,5) P 2 in diesen Zellen für ein Umdenken. Darüber hinaus sind die in dieser Arbeit entwickelten Methoden können auch mit der richtigen Sonden, wodurch bietet neue Werkzeuge zum Studium Phosphoinositiden in biologischen Prozessen zu anderen Membran Phospholipid Forschung angewendet werden.
Die Verwendung von Membranfolien in dieser Arbeit umgeht zwei wichtige Anliegen in Phospholipid morphologische Studien: Detergens-Behandlung und mögliche Signal Kontamination aus dem Cytosol. Waschmittel verursachen oft Clustering und einen erheblichen Verlust von PM Phospholipid-Signal. Die Kontamination von zytosolischen Signal ist besonders problematisch im Fall von geringer Häufigkeit Phosphoinositiden auf der PM 23, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Membranfolienproben sind in der Lage Circumvent diese Probleme ohne wesentliche Strukturen mit der Plasmamembran, wie kortikale Aktin meshwork und Clathrin-beschichtete Pits 42,43 zugeordnet stören. Die relative homogene Verteilung von PI (4,5) P2 in der PM ist in guter Übereinstimmung mit anderen schnellen Einfrieren EM – Studien unter Verwendung von GST-PH PLC δ1 Sonden in der Fibroblasten – Membran 44.
Es ist wichtig zu beachten, dass unsachgemäßer Probenverarbeitungsbedingungen irreführende Ergebnisse erzeugen kann. Erstens ist es wichtig, die Befestigungsschritte bei einer niedrigeren Temperatur (4 ° C) und Verwendung der Fixiermittel GA für Membranfolienherstellung durchzuführen. Wie in 3 gezeigt, warme Temperatur und PFA Fixierung ohne GA ist nicht ausreichend Phosphoinositid in Zelle PM zu beheben. Dies könnte die intakten PI (4,5) P 2 Verteilung verzerren und scharfe Cluster erzeugen , die in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen beobachtet werden , nicht. Zweitens ist die Verwendung von PAmCherry1 alsdie SMLM Sonde, eher als andere Sonden ist, ausschlaggebend für die quantitative PALM-Bildgebung. Der Vorteil der PAmCherry1 Anwendung kommt von seiner gut charakterisierten einzelnen molekularen photophysikalischen Eigenschaften 35,40,45, wie Helligkeit, hohe Photoaktivierung Effizienz und vor allem sehr begrenzt Photo Blinken. Diese Eigenschaften ermöglichen es uns , potenzielle Cluster Artefakte aus Photo Blinken zu beseitigen und quantitativ die molekulare Dichte der Membran PI analysieren (4,5) P 2.
Dieser Ansatz hat auch seine Grenzen. Erstens verwendet das Membranblatt Verfahren in dieser Studie nicht vollständig kann die physiologische Verteilung von PI (4,5) P 2 nachahmen , da die Zelle vor der Abbildung gestört wird. Aber unsere Live – PALM – Bildgebung zeigt ähnliche relativ homogene Verteilung von PI (4,5) P2, die Ergebnisse beobachtet , die mit Membranfolie Proben unterstützen. Zweitens, wie wir in unserer bisherigen Arbeit 23 diskutiert, erfordert SMLM Imaging Expertise und extra antention Bildartefakte zu vermeiden, die von verschiedenen Prozessen, einschließlich der verwendeten Sonden, Probenvorbereitung und Fixierung, Bild Probenahme und Wiederaufbau entstehen könnten. Schließlich, obwohl die PH – Domäne basierte Sonden und Antikörper sind weit verbreitet in der Phosphoinositid Studien 46,47 verwendet worden bleibt es möglich , dass nicht alle PI (4,5) P2 in der Membran kann durch diesen Ansatz nachgewiesen werden. Beispielsweise PI (4,5) P 2 durch andere endogene Proteine gebunden sind, können nicht auf pH – Sonden oder Antikörper zugänglich sein, und dies kann eine Unterschätzung von PI (4,5) P 2 aufgrund der Raum Hinderung der Sonden selbst verursachen. Eine alternative Möglichkeit zur Etikettierung PI (4,5) P 2 würde auf den Schwanz des ursprünglichen Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, a pre-markierten PI (4,5) P 2 Analogon mit einer Modifikation verwendet werden , PI (4,5) P 2. Allerdings kann es schnell in andere Phosphoinositid-Subtypen durch schnelle Live-Zellstoffwechsel umgewandelt werden, da seine Inositolrings die gleiche wie endogenou ists PI (4,5) P 2. Damit stellt sich die Sorge , ob diese voretikettierten PI (4,5) P 2 analoge in lebenden Zellen treu PI (4,5) P 2 nicht seine Stoffwechselprodukte darstellen kann. Daher ist trotz einiger Einschränkungen, PH – Domäne basierte Sonden sind immer noch zu den besten Sonden , die häufig verwendet wurden PI (4,5) P 2 Verteilung und Dynamik auf dem PM von Zellen zu überwachen.
Die künftige Anwendung dieser Methodik kann auf andere Phosphoinositid Studien erweitert werden, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Zusammenfassend verwendet die neuartige SMLM Ansatz eröffnet hier neue Wege Phosphoinositid in Zellen zu untersuchen. Verwendung von PI (4,5) P 2 als Beispiel zeigen wir die einzigartigen Eigenschaften von PALM Bildgebung in die morphologische und quantitative Untersuchung der Zellmembran – Moleküle sowie ihre Nachteile. Dieser Ansatz kann an andere Moleküle von Interessen angepasst werden und breite Anwendungen in der Zellbiologie haben.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |