在质膜用新型荧光探针磷脂酰-4,5-二磷酸的单分子超分辨率成像

1.膜片制备及固定准备贴有IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1膜片制备DNA质粒编码IRFP-PAmCherry1-PH PLC采用标准分子生物学技术δ123。 培养INS-1细胞上＃1.518毫米圆形盖玻片预涂覆有30微克/毫升纤连蛋白50-70％汇合以下标准的INS-1细胞培养协议38,39。转染的细胞每天达到50〜70％汇合后。 用脂质体转染试剂以下制造商的协议δ1转染细胞与IRFP-PAmCherry1-PH PLC。转染后，让细胞生长48小时。 在实验的当天，涂层盖玻片（上一侧）〜0.5 – 1毫升500微克/毫升聚-D-赖氨酸（PDL;用蒸馏水2 O稀释）1-2小时。然后通过放置纸巾流失PDL盖玻片的边缘。放置盖玻片上的预冷（4℃）金属以备后用板。 洗预染INS-1细胞上以〜0.5盖玻片生长 – 含有1mM EGTA 1毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。重复洗三次，沥干PBS。 放置与培养的细胞（细胞侧朝下）上有一对镊子的一预冷却的金属板PDL中涂覆的盖玻片的盖玻片。离开板在7冰箱（4℃） – 10分钟，以允许细胞附着到PDL中涂覆的盖玻片（ 图2）。 注：温育时间应在7〜 – 10分钟使细胞给PDL涂覆表面的更好附着。这款冰箱环境干燥，孵化不宜过长。 从冰箱中取出金属板。轻轻剥离含有用镊子预先转染的细胞在盖玻片。这产生细胞膜片上的薄层PDL涂层的盖玻片。轻轻地用〜0.5洗膜片 – 1毫升冰冷的PBS，然后用〜0.5修复 – 1毫升冰冷的4％多聚甲醛（PFA）+ 0.2％的戊二醛（GA）在PBS中于4℃下15分钟。 注意：多聚甲醛和戊二醛是有毒的。处理它们与皮肤和眼睛的保护在通风橱。 固定后，图像的膜片立即（见第3节）或〜0.5存储在 – 1ml的PBS于4℃。 注：定影膜片后，将没有平衡从胞质溶胶对PI（4,5）P2的PH探针的结合。结合的PH探针会逐渐从膜片分离并扩散到溶液（尽管它可能需要数天到数周）。因此，样品制备后立即建议图像的固定的样品。 准备膜片的PI（4,5）P2特异性抗体标记培养INS-1细胞上＃1.5 18毫米的圆形盖玻片预涂覆有30＆＃181;微克/毫升纤连蛋白，以50％-70％汇合。如在步骤1.1.3中所述转染的细胞与DNA质粒的第二天。 重复从1.1.4步骤如上所述1.1.7。 注：在4℃执行下列步骤。 洗含有固定点片三次以〜0.5的盖玻片-含有50mM NH 4（CL 1）毫升冰冷的PBS中。淬火以〜0.5的片材-在PBS中1毫升0.1N％的硼氢化钠7分钟，并用清洗〜0.5 – 1ml的PBS（不含50mM的NH 4 Cl）的。 封锁〜0.5的样品- 1毫升封闭溶液45分钟（含5％（体积/体积）正常山羊血清，5％（体积/体积）牛血清白蛋白和50mM 氯化铵 PBS溶液）。在1小时封闭液：（300稀释1）1毫升主要PI（4,5）P2抗体-然后，孵育〜0.5。含有50mM 氯化铵 1ml的PBS -以〜0.5洗涤三次（每次10分钟）。 孵育样品〜0.5 – 1毫升次级的F（ab'）2山羊抗小鼠抗体与荧光团（1：300）缀合在1小时封闭缓冲液。 1ml的PBS – 以〜0.5洗涤三次。 与修复交样品4％PFA + 0.2％的GA 15分钟，然后再洗涤样品三次，用PBS（每次7分钟）。进行到第3节成像或〜0.5〜1毫升的PBS在4℃保存以备后用。 注：在4℃制备样品。使用4％PFA + 0.2％的GA固定液以保留在PM磷酸肌醇的生理分布。 RT制备或固定单独用4％PFA可能引起显著工件（ 图4）。 2.细胞培养制备与mEOS3.1-PH PLCδ1活细胞成像制备如前面23所描述编码mEOS3.1-PH PLCδ1的DNA质粒。 培养INS-1细胞上＃1.518毫米圆形盖玻片预涂覆有30微克/毫升纤连蛋白，直到他们达到50％-70％confluency下列标准INS-1细胞培养协议38,39。 第二天，转染INS-1细胞，使用脂质体转染试剂以下制造的协议δ1DNA质粒的mEOS3.1-PH 的PLC。孵育前成像48小时。 膜片和活细胞PALM 3.图像采集手掌图像采集膜片的注意：在此，全内反射荧光（TIRF）显微镜基于SMLM系统（100X油，APO，NA = 1.49，WD0.12毫米）23被用于所有的图像采集。 成像前，稀1μl的荧光珠溶液的10ml PBS + 50mM的MgCl 2的。加入200μl稀释液入含有成像室的细胞样品（从步骤1.1.8 / 1.2.6）10分钟。然后，用PBS洗三次。 启动PALM成像系统。在相关的图像处理软件，选择“IRFP信道＃34;按钮（642 nm激光激发，七十五分之七百nm发射）。发现细胞膜表达PH探头在IRFP通道。 注：膜片应该有附近的荧光珠。这是必需的漂移校正以后。 使用“捕捉”按钮来收集细胞膜IRFP通道的常规TIRF图像作为未来图像重建的参考。通过在TIRF角度设置成像2140键入SET正常TIRF角度（ 即 ，在到达临界角后，又转1.5度）。使用这个角度除非另有说明设置的所有步骤。 注意：在这里描述的TIRF系统，3500是垂直向上的角度2200是TIRF临界角，和2140是普通的TIRF角度，这是以后的TIRF临界角1.5度以上。 3.2.3下面提到的窄TIRF角度为2120，这是达到TIRF临界角接连2度。 通过单击日切换到PAmCherry1通道ËRFP通道按钮（561 nm激发，五十零分之六百nm发射过滤器）。一路调整滚动条中的“AOTF”垫右侧有561 nm激光的全功率照明10-20秒漂白背景膜荧光。 在“格式”选项卡，并在“ND序列采集”选项卡中的快速采集协议设定最佳相机设置（2×2融合）（通常在20赫兹10,000-40,000图像）。 点击“立即运行”按钮 – 在较低水平（1％0.1％）开始收购PAmCherry1图像（561 nm激光在满功率，50毫秒/帧）并同时405 nm激光激活。调整405nm的激光的强度，从而在每一帧中在空间上分离的各个点是容易辨认。 注：可活化PAmCherry1分子的数目采集过程中逐渐减小。 405nm的激光强度应逐渐增加，以保持在每个单独的分子信号的最优密度帧。 继续获取图像，直到没有PAmCherry1单分子信号被激活。 PALM成像在活细胞中成像前，如在步骤3.1.1中所述稀释荧光珠进入成像室10分钟。然后，打开相关的成像软件启动Palm成像。 注：使用活细胞成像的磁性快速释放成像室。保持摄像视场的在35℃下恒定灌注与细胞外缓冲液（胞外溶液温度控制器的中心：135 mM氯化钠，5.6毫摩尔的KCl，2.6毫摩尔氯化钙 ，1.2mM的MgCl 2的，3毫米的葡萄糖，和20mM HEPES; pH值= 7.3）。 选择GFP通道按钮（五十零分之五百二十五nm发射）。识别细胞膜根据下488 nm激光激发从mEOS3绿色荧光表达荧光探针。确保荧光珠附近的成像，因为这期间还包括在以后需要离线DRI英尺修正。 点击“捕获”按钮，收集细胞膜的mEOS3（绿色）通道TIRF图像作为参考图像。通过在TIRF角度设置活细胞成像在2120打字使用浅倏逝波激发照明（在达到临界角后，又转2度）。 注意：这最小化与未结合mEos3-PH在胞质溶胶相邻质膜的荧光。 切换到“RFP通道”按钮（561 nm激发，五十零分之六百nm发射）。使用全功率561 nm激光漂白为10〜20秒，在“AOTF垫”滚动条的膜片的背景荧光（见3.1.4）。 通过单击红色通道“立即运行”按钮（561 nm的全功率，在“相机”设置选项卡设置为10毫秒/帧）并同时405 nm激光激活启动图像采集。调整405纳米的激光强度来激活空间分离点在每个帧中。 注：为获取收益，未转换mEOS3.1-PH PLCδ1分子数缓慢下降。逐渐增加405nm的激光功率来优化单分子的信号。成像采集长度取决于实验目的。连续采集的图像在正常条件下5分钟。如果需要更长的采集，收集多个图像堆栈，而不是一个单一的，大的图像堆栈。每个图像栈的文件大小不得超过4 GB或稍后会影响软件分析。 4. SMLM图像处理与重建图像文件（.TIF图像堆栈）转移到一个图像分析站。如前所述37在Matlab启动图像重建程序（定制编写的），并通过点击主菜单中的“文件”选项卡中加载图像堆栈，然后在“打开”，然后选择“新建文件”。 识别和LOCA丽泽从每一帧单独分子事件。设置过滤强度阈值与在“小波”阈值数量（1-10）。重建前直观地验证点检测的最佳参数设置。然后去“掌”选项卡，然后单击“一步过程”，开始图像重建。 注：点检测强度阈值是任意的，取决于个人的经验。几个试验可能需要产生一个最佳的检测阈值，无论是拿起了太多的不合格（DIM）点也过滤掉过多的限定（亮）点。调整其他参数来优化数据分析。这里，附近的距离（在一个范围内的相邻帧组合荧光点）被设定为65纳米（1/2象素宽度）和嵌合作为单个分子。峡帧（这些帧和邻里的距离内发生合并，拟合为单分子事件的个别分子事件）是设定为26帧（1.3秒）PAmCherry1成像40。根据单分子探测和捕获率的属性，以避免在SMLM过计数40调整这些参数。在重建过程中的荧光珠应用漂移校正。 用于成像由IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1标记固定膜片，重建从同一膜片整个图像堆栈成一个单一的超分辨率图像37。 用于通过mEOS3.1-PH PLCδ1标记活细胞样本，整个图像堆栈分离成1000帧的几个较小的堆，使得1000连续帧堆栈被重构为单个超分辨率图像，其具有时间分辨率10秒。在结束时，将所有的时间序列图像到最后的时间序列栈23。 注：在活细胞成像PALM，激活探头少数可移动或分离从PI（4,5）P2漂白前的PM。为了考虑探针的过采样，图像分析过程中结合个别分子信号（而不是65纳米）130纳米范围内的相邻帧为单个发射事件。 获得的重建图像后，开展与在Matlab定制编写的程序来量化分子密度，微域密度/大小和集群对相关41分析进一步的图像分析。