Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Zebrafish의 근육 발달은 매우 그들에게 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델을 만드는 포유류 시스템에 보존되어있다. 골격근의 기능에 영향을 미치는 많은 근육 병증 쉽고 빠르게 배아의 처음 며칠 제브라에서 평가 될 수있다. 24 시간 후 수정 (HPF)으로 야생형 제브라 피쉬는 자발적으로 자신의 꼬리 근육을 수축, 48 HPF, 제브라 피쉬 전시 제어 수영 행동으로. 주파수 감소, 또는 다른 변형이 이러한 운동은 골격근 기능 장애를 나타낼 수있다. 수영 동작을 분석하고 초기 제브라 피쉬 개발에 근육의 성능을 평가하기 위해, 우리는 모두 터치 유발 탈출 응답 및 운동 분석을 사용한다.
터치 유발 이탈 반응 분석은 고속 트 위치 근육 섬유의 수축으로 인한 짧은 버스트 동작시 근육의 성능을 평가하는데 사용될 수있다. 이 경우에는 수돗물이 외부 자극에 응답하여머리, 포스트 수정 (DPF) 2 일째 야생형 제브라 피쉬는 일반적으로 날카로운 회전과 함께 강력한 버스트 수영을 나타낸다. 우리의 방법은 가속도 근육 수축에 의해 생성 된 힘에 직접 비례하는, 버스트 수영 동작시의 최대 가속도를 측정함으로써 골격근 기능을 정량화한다.
반대로, 초기 제브라 유충 발달 동안 운동 분석은 근육 활동의 지속 기간 동안 근육의 성능을 평가하기 위해 사용된다. 수영 동작을 모니터링하는 추적 시스템을 이용하여, 자신의 골격근 기능의 반사 6 일된 제브라 활동 거리와 주파수의 자동 산출을 행한다. 수영 성능 측정은 질병 모델과 골격 근육 기능에 영향을 미치는 돌연변이 또는 화학 처리의 높은 처리량 검사의 표현형 평가 가치가있다.
지난 십년 동안 점점 제브라 근육 세포 생물학 및 질병을 연구하는데 사용되었다. 광학적 선명도와 결합 된 제브라 피쉬 배아의 급속한 외부 개발, 근육 형성, 성장, 그리고 기능의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 근육 발달의 과정은 매우 제브라에서 보존되고,이 근육 이영양증 근육 병증 선천성 1-8 포함한 근육 질환의 범위의 성공적인 모델링을 허용했다. 제브라 피쉬 모델의 상세한 검사는 이러한 조건의 병리 생물학에 새로운 통찰력을 제공뿐만 아니라 적절한 치료 6,9-13의 테스트를위한 플랫폼을 제공 한 사실이 없습니다.
근육 질환 제브라 모델의 분석은 근육의 성능을 측정하는 신뢰성 있고 재현 가능한 분석에 의존한다. 이전의 연구에 의해 성공적으로 DPF (3,7) 사이 물고기 제브라 피쉬 트렁크 근육 힘 생성 능력을 측정했다전기적 힘 전달 시스템 (14)에 부착 된 고정 물고기의 수축을 자극. 이 힘의 상세한 측정을 제공 할 수 있지만 이상적으로 높은 처리량 실험에 적합하지 않은 수영시 근육의 성능을 측정하는 장점이있다. 제브라 피쉬의 근육 DPF 2에서 완벽하게 작동하고 물고기는 자극에 반응 버스트 수영의 움직임을 유도 할 수 있습니다. 터치 연상 이탈 반응 분석법 수축력의 척도로 사용될 수 버스트 수영 운동시 가속을 측정하는 데 사용된다.
근육 병증 환자에서 근육 기능의 대부분의 활용 방법 중 하나는 총 거리가 하드 평평한 표면 (15, 16)에 걸어 기록 6 분 도보 테스트입니다. 우리는 전체 거리 swum과 모니터링함으로써, 제브라 유충 DPF 6 근육 기능을 측정하기 위해 비교 테스트를 적용하고 10 분 동안 각각의 유충에 의해 움직임의 총 수있다. 이 수행근육의 성능과 신뢰성이 높은 처리율 측정을 제공하는 자동화 추적 시스템을 사용. 두 근육 검사 재현성 있고 제브라 근병증 모델 팔 근육의 성능 차이를 정량화하는 데 사용되어왔다.
쥐, 개, 제브라 피쉬, 파리와 벌레 등 다양한 동물 모델은 근육 질환의 유전 및 분자 기초에 대한 우리의 이해를 향해 기여하고 대처하기 위해 치료 방법의 개발을 지원하고있다. 제브라 피쉬 근육 질환 연구를위한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 제브라 피쉬는 시험 관내 배양 시스템에서 불가능 적합한 생리 환경에서 복잡한 근육 패턴을 평가하기 위해 유전자 조작 가능한 시스템을 제공한다. 다른 척추 동물 모델과 달리, 서로 광학적 투명도로 제조 물고기의 다수의 생체 내 화학적 및 유전자 선별 빠르고 높은 처리량을 용이하게한다.
여기서 우리는 제브라 피쉬 배아시 근육의 성능을 평가하기 위해 높은 처리량 및 자동화 된 방법을 제공하는 제브라 이동 분석법의 개발을 기술한다. 모두 분석 것은 인정해야하는 일주기 리듬과외부 환경의 자극이 크게 zebrafish의 수영 동작 (17, 18)에 영향을 미칠 것입니다. 같은 제브라 피쉬의 반복 시험은 23 자극 촉감에 반응 감소의 원인이 습관화으로 이어질 것입니다. 따라서, 실험 간 재현성있는 결과를 각 지브라 피쉬 배아를 달성하기 위해 단지 일 및 조명 조건의 시간을 표준화해야 한번 검사 및 수온 조절 단단해야한다.
우리가 직접 근력에 비례 버스트 수영 작용하는 최대 가속도를 측정 할 수있는 DPF 터치를 사용하여이 분석에서 유발. 제브라 피쉬의 이전 기술 측정 전계 및 근육 (14)의 힘 – 생성 능력을 사용하여 자극 근육 수축 실험 장비 다음과 배아의 양단 매로 근력을 조사했다. 이 방법은 t의 용량을 생성하는 힘을 측정하는 동안그는 애벌레 근육이 수영하는 동안 애벌레 근육에 의해 생성 된 실제 힘을 측정하지 않습니다. 따라서 우리는 간접적 근육 상태의 전체 측정 값을 제공하기 위해 통상의 유충 수영 동작 중에 발생하는 힘을 평가하기위한 방법을 개발 하였다. 1000 프레임들의 프레임 레이트로 개별 지브라 피쉬의 움직임을 기록 할 수있는 고속 비디오 시스템은 / 초 눈하여 구별 할 수없는 근육 기능 작지만 상당한 차이를 식별하는 데 사용될 수있다. 그것은 전기 자극 힘 세대의 변화 수영 성능의 변화와 상관 관계를보고하는 방법 이전에보고 관심이 될 것입니다.
또한 터치 응답 분석도 locomotory 동작의 정량적 측정을 제공하기 위해, 예를 들면 수영장 모션 24시 본체 파의 형상 및 속도와 같은 수영 역학을 평가하는데 사용될 수있다 유발.
때문에 zebraf의 자발적인 운동틱 유충 3 DPF 후에는 근육 기능을 측정하는 터치 연상 분석을 수행 할 수 없었다. 반대로, 우리는 6 DPF에 제브라 유충 swum과의 거리를 결정함으로써, 장기간에 걸쳐 근육의 성능을 측정 하였다. 이 시험은, 근육 기능을 간접적으로 측정되지만, 생선 손상된 근육 퇴행 성능 8 25,26 표시를 식별 할 수있다. 이 테스트는 6 분 도보 테스트 유사한 측정을 제공뿐만 아니라 생체 내 약물이나 돌연변이 화면에 자동으로 높은 처리량에 적합뿐만 아닙니다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
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Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
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Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |