Использование сенсорного вызванной реакции и локомоции Анализы для оценки производительности мышц и функции в данио рерио
概要
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
Развитие рерио мышц высоко консервативен с системами млекопитающих делает их отличной моделью для изучения мышечной функции и болезни. Многие миопатия, влияющие на функции скелетных мышц может быть быстро и легко оценить в данио в течение первых нескольких дней эмбриогенеза. К 24 ч после оплодотворения (ФВЧ), дикого типа данио спонтанно сокращаться свой хвост мышцы и на 48 часов после оплодотворения, данио экспоната контролируемое плавание поведения. Снижение частоты, или другие изменения в эти движения могут свидетельствовать о дисфункции скелетной мускулатуры. Для анализа поведения плавания и оценить работу мышц в начале данио развития, мы используем оба прикосновению вызвали отклика и локомоции анализы побега.
Анализы ответа эвакуации Сенсорные вызванные могут быть использованы для оценки производительности мышц во время коротких движений лопнувших в результате сокращения быстро сокращающихся мышечных волокон. В ответ на внешний стимул, который в данном случае является нажатие наголова, дикого типа данио через 2 дня после оплодотворения (DPF), как правило, обладают мощным всплеском купанием, сопровождающееся резкими поворотами. Наш метод квантифицирует функции скелетных мышц путем измерения максимального ускорения во время движения плавательного взрыв, ускорение прямо пропорционально силе, вызванной сокращением мышц.
В противоположность этому, локомоции анализы на ранних стадиях развития данио личиночной используются для оценки производительности мышц в течение длительных периодов активности мышц. С помощью системы слежения, чтобы отслеживать поведение плавание, мы получим автоматизированный расчет частоты активности и расстояния в 6-дневного возраста данио, отражающую их функции скелетных мышц. Измерения производительности плавания являются ценными для оценки фенотипического моделей заболеваний и высокопроизводительного скрининга мутаций или химических обработок, влияющих на функции скелетных мышц.
Introduction
За последнее десятилетие данио все чаще используется для изучения биологии клетки мышц и болезни. Быстрое внешнее развитие данио эмбриона, в сочетании с его оптической прозрачностью, позволяет прямой визуализации формирования мышц, роста и функции. Процесс развития мышц высоко консервативен в данио , и это позволило успешное моделирование целого ряда мышечных заболеваний , в том числе мышечной дистрофии и врожденных миопатий 1-8. Подробное исследование данио моделей не только обеспечил новые идеи в патобиологии этих условий , но и предоставляет платформу для тестирования подходящих методов лечения 6,9-13.
Анализ данио моделей мышечных заболеваний зависит от надежных и воспроизводимых анализов для измерения производительности мышц. Предыдущие исследования показали, успешно измерили генерирующую способность силы данио ствола мышцы у рыб между 3 и 7 DPF путемэлектрически стимулируя сокращение иммобилизованной рыбы , прикрепленной к системе 14 силы трансдукции. Это может обеспечить детальные измерения силы, но не идеально подходят для более высоких экспериментов пропускной способности и есть преимущества для измерения производительности мышц во время плавания. На 2 DPF данио мышцы является полностью функциональной и рыба может вызвать взрыв плавательные движения в ответ на раздражители. Анализ реакции побег сенсорный -позволяют используется для измерения ускорения во время движения плавательного взрыв, который может быть использован в качестве меры сжимающей силы.
Одним из наиболее используемых мер мышечной функции в миопатия пациентов тест прогулки 6 мин, который записывает общее расстояние ходил по твердой ровной поверхности 15,16. Мы применили сопоставимый тест для измерения мышечной функции в 6 денье, данио личинок, в результате чего мы контролируем общее расстояние плавал, а общее количество движений, сделанных каждым личинку в течение 10 мин. Это выполняетсяс помощью автоматизированной системы слежения, которая обеспечивает надежную и высокую пропускную способность измерения производительности мышц. Обе мышечные тесты хорошо воспроизводимым и были использованы для количественной оценки различий в производительности мышц в данио миопатия моделей 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Много различных моделей на животных, включая мышей, собак, данио, мух и червей внесли свой вклад в наше понимание генетической и молекулярной основе мышечных заболеваний, а также помощь в разработке терапевтических подходов к борьбе с ними. Данио имеет ряд преимуществ для изучения болезни мышц. Данио обеспечивает генетически манипулируемо систему для оценки сложной мышечной кучность в подходящей физиологической среде, что невозможно сделать в культурах клеток. В отличие от других позвоночных животных моделей, большое количество рыбы , производимых, вместе с его оптической прозрачностью, способствует быстрому, высокой пропускной способности в естественных условиях химического и генетического скрининга.
Здесь мы опишем развитие данио анализов движения, чтобы обеспечить высокую пропускную способность и автоматизированный метод оценки производительности мышц во время данио эмбриогенеза. Для обоих анализов следует признать, что циркадные ритмы ивнешние стимулы окружающей среды существенно влияет на поведение данио плавание 17,18. Повторное тестирование того же данио также приведет к привыканию приводит к уменьшению в ответ на тактильные стимулы 23. Поэтому для того, чтобы достичь воспроизводимых результатов между экспериментами каждый данио эмбрион должен быть проверен только один раз, время суток и условий освещения должны быть стандартизированы, и температура воды должна быть жестко регулируется.
Использование сенсорного анализа вызвали в 2 денье мы можем непосредственно измерить максимальное ускорение плавательным разрыва действия, которая пропорциональна мышечной силы. Предыдущие методы в данио исследовали мышечную силу, связывая оба конца эмбрионов экспериментальным следующее оборудование , которое сокращение мышц стимулируется с помощью электрического поля и силовоспроизводящую способность мышцы 14 измеряется. Хотя этот метод измеряет силу установочную мощность тон личиночной мышцы, он не измеряет фактическую силу, произведенную личиночной мышцы во время плавания. Поэтому мы разработали метод косвенно оценить силу, произведенную во время нормального движения личиночной плавание, чтобы обеспечить общую меру здоровья мышц. Система видео высокой скорости, способный записывать отдельные данио движения с частотой кадров 1000 кадров / сек могут быть использованы для выявления небольших, но существенных различий в мышечной функции, которые не являются непосредственно различимы невооруженным глазом. Это будет интересно посмотреть, как сообщалось ранее изменения в электрически стимулированной силы поколения коррелируют с изменениями в производительности плавания.
Кроме того, сенсорный вызванные анализы ответа также могут быть использованы для оценки плавания кинематику, таких как форма и скорость волны тела во время движения плавательного 24, чтобы дать количественное измерение опорно – двигательного поведения.
Из-за спонтанного движения zebrafиш личинки после того, как 3 денье, мы не смогли выполнить прикосновению вызывают анализы для измерения мышечной функции. С другой стороны, мы измерили производительность мышц в течение длительного периода путем определения расстояния купался путем данио личинок на 6 DPF. Этот тест, хотя и косвенной мерой мышечной функции, могут быть использованы для идентификации рыбы , отображающее нарушенную работу мышц 8 или нейродегенерации 25,26. Этот тест не только обеспечивает измерение аналогичное испытанию на 6 мин ходьбы , но также подходит для автоматизированной высокой пропускной способностью в естественных условиях экранов наркотиков или мутагенеза.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
参考文献
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
