Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
斑马鱼的肌肉发育高度与哺乳动物系统使他们成为优秀的模型来研究肌肉功能和疾病保守。影响骨骼肌功能多肌病可以在斑马鱼在胚胎发育的最初几天快速,方便地进行评估。通过后24小时受精(HPF),野生型斑马鱼自发收缩其尾部的肌肉和由48 HPF,斑马鱼表现出受控游泳行为。减少的频率,或者在其它的改变,这些运动可以指示骨骼肌功能障碍。为了分析的游泳行为和早期斑马鱼发育评估肌肉性能,我们利用两个触摸诱发逃避反应和运动检测。
触诱发逃避反应测定法可以用于评估在从快肌纤维的收缩引起的短脉冲动作肌肉性能。响应于外部刺激,在这种情况下是上一抽头头部,于2天后受精(DPF)野生型斑马鱼通常呈现出爆发出强大的游泳,伴随着急转弯。我们的方法是由一个脉冲串游泳运动期间测量的最大加速度,所述加速度被直接正比于由肌肉收缩产生的力量化骨骼肌功能。
相比之下,早期的斑马鱼幼体发育过程中运动试验是用来在肌肉活动持续时间来评估肌肉性能。使用追踪系统,以监测游泳行为,我们得到的活性和距离的频率在6天龄的斑马鱼的自动计算,反射其骨骼肌功能的。游泳的性能测量是疾病模型,影响骨骼肌功能突变或化学处理的高通量筛选的表型的评估价值。
在过去的十年,斑马鱼已经被越来越多地用于研究肌细胞生物学和疾病。在斑马鱼胚胎,加上其光学清晰度的快速发展外,允许肌肉形成,生长和功能的直接可视化。肌肉发育的过程是高度保守的斑马鱼,这使得一系列肌肉疾病,包括肌肉萎缩症和先天性肌病1-8成功造型。斑马鱼模型的详细检查,不仅提供了新的见解的这些条件下,病理学,但也提供了一个平台,合适的治疗6,9-13的测试。
肌肉疾病的斑马鱼模型的分析依赖于可靠和可重复的实验来测量肌肉性能。先前的研究已经成功地测量3和7之间的鱼的斑马鱼躯干肌肉由DPF的力产生能力电刺激附连到力传递系统14的固定化的鱼的收缩。这可提供的力详细的测量,但不适合于更高的吞吐量实验和有向游泳期间测量肌肉性能的优点。在2 DPF斑马鱼的肌肉功能全面,并且鱼可以对刺激的反应引起的突发游泳运动。触引起逃避反应测定法中使用的脉冲串的游泳运动,它可以用来作为收缩力的量度期间测量加速度。
在一个病人肌病肌肉功能使用最多的措施是6分钟步行试验,记录在坚硬平整的表面15,16的总距离走去。我们已在6施加一个可比试验,测定肌肉功能的dpf斑马鱼,由此我们监测的总距离游过,并且由每个幼虫在10分钟内取得运动的总数。这被执行使用自动跟踪系统,它提供的肌肉性能可靠和高通量测量。两个肌肉测试是高度可再现,并已用于量化在斑马鱼肌病模型8肌肉性能的差异。
许多不同的动物模型,包括小鼠,狗,斑马鱼,苍蝇和蠕虫已经对我们的肌肉疾病的遗传和分子基础的认识作出了贡献,并在打击这些治疗方法的发展援助。斑马鱼拥有了肌肉疾病的研究几个优点。斑马鱼提供了一种转基因可操纵系统,以评估在合适的生理环境,这是不可能的, 在体外培养系统中复杂的肌肉图案化。不像其他脊椎动物的动物模型,大量生产的鱼,其光学透明度在一起,方便快速,高通量体内的化学和遗传筛查。
这里,我们描述斑马鱼运动测定的发展提供了高通量和自动化方法斑马鱼胚胎发生期间,以评估肌肉性能。对于这两种检测必须承认,昼夜节律和外界环境的刺激会显著影响斑马鱼游泳行为17,18。相同的斑马鱼的反复测试也将导致习惯响应于触觉引起的降低刺激23。因此,为了实现实验之间可重现的结果各斑马鱼胚胎只应测试一次,当天和照明条件的时间应标准化,并且水温需要被紧密调节。
使用触摸在2诱发分析旦我们可以直接测量突发游泳动作,这是成正比的肌肉力量的最大加速度。在斑马鱼先前的技术已通过把胚胎实验设备以下是使用电场和肌肉14的力产生能力哪些肌肉收缩刺激的被测量的两端检测肌肉力量。虽然这种方法测量力产生的T能力他幼虫肌肉,它不游泳期间测量由幼虫肌肉产生的实际力。因此,我们发展到间接评估正常幼虫游泳运动过程中所产生的力,提供肌肉健康的一个全面衡量的方法。高速视频系统中,能够记录在1000帧的帧速率单独斑马鱼的动作/秒,可用于识别在肌肉功能小而显著的差异,这是不被眼睛直接识别。这将有兴趣来看看如何此前报道的电刺激力产生变化,在游泳的性能变化相关。
除了触摸诱发反应测定法也可以用于评估游泳运动,如游泳运动24在体波的形状和速度,以得到运动器官行为的定量测量。
由于斑马鱼的自发运动肥胖幼虫后3旦,我们无法进行触摸唤起测定以测量肌肉功能。相反地,我们通过测定在6单丝旦由斑马鱼的距离游过测量在较长时期内的肌肉性能。该试验中,虽然肌肉功能的间接测量,可被用来识别鱼显示受损肌肉性能8或神经变性25,26。这个试验不仅提供类似于6分钟步行试验的测量,但也适用于自动化高通量药物在体内的或诱变的屏幕。
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
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http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
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Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
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