制备及胸腺器官切片文化中的应用

T细胞分化，通过在此期间，他们遇到几个检查点，以确保一个功能，自我耐受T细胞库^1-3的产生胸腺一系列发育中间体。阳性选择促进与T细胞受体（TCR），能够识别的，具有低到中度亲和力，肽由皮质胸腺上皮细胞^{（CTEC）2,3-}主要组织相容性复合体分子（MHC）呈现胸腺细胞的存活。阴性选择和调节性T（T _REG）细胞发育有助于通过消除或转移强烈由MHC ^2,4提出自身肽反应胸腺细胞的建立自身耐受。未成熟CD4 ⁺ CD8 ⁺双阳性（DP）胸腺细胞表达了通过选择过程分化成成熟T细胞亚群的TCR，其中大部分是MHC I类限制性CD8 ⁺细胞毒性或MHC II类限制性CD4 ⁺辅助单阳性（SP）T细胞中，离开胸腺在次级淋巴器官^1-3执行效应器功能之前。

添加到T细胞发育的复杂性是动态迁移并在整个基质细胞网络^5-9显影胸腺细胞的细胞接触。这些基质细胞在胸腺细胞发展中发挥不同的作用，并在那里阳性和阴性选择发生¹⁰胸腺皮质和髓质区之间被差异分布。虽然正选择主要发生在皮质，有越来越多的证据认为DP胸腺细胞迁移到髓质和继续需要的TCR信号它们分化成成熟T细胞暗示髓质可提供必要的正选择和谱系完成附加的信号之前分化^11,12。进一步，尽管表达专门髓质胸腺上皮细胞（MTEC）和本组织限制性抗原促进自身反应性胸腺^13,14的缺失的情况下，阴性选择的相当大的比例发生在响应皮层到遍在表达自身肽树突呈现细胞^15,16。因此，T细胞发育的准确的模型必须提供高度组织胸腺微环境，具有完整皮层和髓质区，便于胸腺细胞和基质细胞之间的相互作用，并支持胸腺细胞迁移，因为这些细胞经历阳性和阴性选择。

为了补充体外胸腺细胞分析作为研究阳性和阴性选择，一些在体外，原位的手段，并在 T细胞发育的体内模型已经开发^17-22。它已经非常难以概括在体外的积极选择，但表达Notch配体干细胞群或基质细胞T细胞前体共培养，特别是OP9-DL1 / 4的细胞，具有支持T系的承诺和有限的正向选择的能力使其成为一个非常宝贵的体外模型研究T细胞发育^23-25。本系统的限制，但是，包括这些细胞缺乏胸腺基质细胞上发现的唯一的肽加工机械和三维胸腺微环境的事实。

虽然在技术上更为繁琐，就地和胸腺选择的体内模型可以克服一些与体外系统的障碍。 Reaggregate胸腺器官培养（RTOC）包含定义的胸腺细胞和胸腺基质细胞^18,26,27的混合物。这些胸腺上皮细胞reaggregates保持MHC I类和II表达并且可以支持DEVELOPME常规T细胞亚群的NT，但仍然缺乏定义的皮质和髓质结构。胎儿胸腺器官培养（FTOC）是T细胞发育的一个流行的模型，可以通过lymphodepleted胸腺叶或通过胸腺细胞注射悬滴文化的胸腺细胞被接种到lymphoreplete胸腺叶和支持CD4 ⁺和CD8 ⁺ T的高效发展在细胞培养^18,28-31时间。在胎儿胸腺瓣培养开始有mTECs的缺乏，但根据条件定义皮质和髓质结构可以随时间发展。一个重要的考虑是，该模型可优先支持胎儿对成人T细胞的发展。最后，在成年小鼠胸腺中定义的前体胸腺内注射在技术上具有挑战性，但显然提供了一个环境，以支持 T细胞发育体内 。这些原位 和体内模型是优秀的快工具Ø研究T细胞发育，其使用应在一个实验按实验基础上加以考虑。

胸腺片，然而，最近已成为一个通用的，互补的模型，研究胸腺选择就地与可能性，以适应独特的，复杂的，并且通常更高的吞吐量实验。胸腺片保持皮质和髓质区的完整性并提供基质细胞的框架，开发以及高效阳性和阴性选择^11,32-39期间支持胸腺细胞迁移。添加顶上胸腺切片胸腺细胞亚群迁移到组织到相应的微环境利基^34,37。的重叠胸腺细胞可以从胸腺切片内源性细胞经由同类标记或荧光标记来区分，并可以在培养物中维持数天。胸腺器官切片文化，可以用来研究的各个方面T细胞发展，包括胸腺选择，胸腺细胞行为（迁移和细胞相互作用），和胸腺细胞定位，等等。给生成每只小鼠〜20胸腺切片的能力，实验的可扩展性通常比在胸腺选择的原位模型其他更大。虽然胸腺切片的制备需要专门的设备，如vibratome，并且由于通过细胞死亡随着时间的推移细胞的损失和缺乏包封膜被限制在培养胸腺片的使用寿命，胸腺片提供了一个极好的模型对于一个成熟的胸腺微环境胸腺细胞同步群体的胸腺选择的分析。在这里，我们描述了胸腺片（包括收获的胸腺，胸腺裂片的琼脂糖嵌入和嵌入的组织的vibratome切片），隔离和胸腺细胞的重叠，并解离为流式细胞仪分析胸腺切片的制备方法。