Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em> Drosophila</em> Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A capacidade de adaptação e respondem ao ambiente externo é crítica para a sobrevivência de todos os animais. Um animal precisa para evitar perigos, procurar comida e encontrar companheiros, e aprender com experiências anteriores. sistemas sensoriais funcionar para receber uma variedade de estímulos visuais, tais como, química e mecanosensorial, e envia esses sinais para o sistema nervoso central a ser interpretada e descodificado. O cérebro, em seguida, direciona comportamentos motores apropriadas com base no ambiente percebido, como a busca de alimento ou escapar de um predador. Entender como sistemas sensoriais detectar o mundo externo, e como o cérebro decodifica e dirige decisões, é um grande desafio em neurobiologia.

Drosophila melanogaster é um sistema poderoso modelo para investigar como neural comportamentos circuitos de guia. Além de ser simples e barata de manter, Drosophila apresentam muitos comportamentos diversos e complexos estereotipada, mas fazê-lo com uma compact sistema nervoso de cerca de 100.000 neurônios. Existem técnicas genéticas poderosas para manipular o genoma de Drosophila, e milhares de linhas transgénicas foram geradas que seletivamente e reprodutível rotular os mesmos subconjuntos de neurônios ^10-13. Estas linhas transgénicas podem ser usadas para manipular selectivamente a actividade dos neurónios marcados (activar ou inibir), e estas manipulações podem ser utilizados para investigar como neural comportamentos funções de guia.

Vários ensaios comportamentais têm sido desenvolvidos para estudar vários comportamentos de Drosophila. Drosophila, como muitos animais, use seu sentido de cheiro para guiar muitas escolhas comportamentais, tais como encontrar comida, encontrar companheiros e evitar perigos. Olfato é, portanto, um bom sistema sensorial para investigar como os estímulos externos são detectados e interpretados pelo sistema nervoso de um animal para orientar as escolhas apropriadas. Como tal, uma série de ensaios foram desenvolvidos para Investigating larval e comportamentos olfativos adultos. Tradicionalmente, os comportamentos olfactivos em Drosophila foram ensaiadas por um paradigma de labirinto em T de dois escolha, que pode ser utilizado para ensaiar inata e comportamentos aprendidos olfactivos ^3. Neste ensaio, cerca de 50 moscas são dado uma escolha entre dois tubos: um tubo contém o odor em questão e o outro contém um odorante de controlo (normalmente o solvente odor). As moscas são dadas um determinado período de tempo para fazer uma escolha, e, em seguida, o número de moscas que estão nas diferentes câmaras são contados. Embora o labirinto em T é um ensaio simples para muitas experiências, há várias limitações. Por exemplo, comportamentos olfativos são medidos em apenas um ponto no tempo, e diferentes escolhas feitas antes deste ponto de tempo são descartados. Da mesma forma, os comportamentos individuais das moscas dentro da população são negligenciadas. Além disso, o labirinto em T requer a contagem manual das moscas, que pode introduzir erros. Finalmente, uma vez que existem apenas duas opções de medição, estereduz o poder estatístico muitas vezes necessária para detectar mudanças comportamentais sutis. Uma alternativa para um dois-escolha T-maze é um de quatro quadrantes (quatro campos) olfatômetro ^14-18. Neste ensaio, os animais explorar uma arena em que cada um dos quatro cantos da arena é preenchido com uma fonte potencial de ar odorizado. A arena tem uma forma de estrela enrugada para maximizar a formação de quatro quadrantes de odor experimentalmente definidos. Se o odor é fornecido em um dos cantos em seguida, é contida apenas em que um quadrante. Os comportamentos dos animais pode ser rastreado como eles entram e saem do quadrante odor, e facilmente em comparação com o seu comportamento nos três quadrantes de controle. Assim, o ensaio olfatômetro de quatro quadrantes registros de resposta comportamental espacial e temporal aos estímulos odor mais de uma grande arena experimental.

O olfatômetro de quatro quadrantes foi desenvolvido pela primeira vez por Pettersson et al. ¹⁵ e Vet et al. ¹⁷ para investigar o olrespostas comportamentais fábrica de Hymenoptera parasítica indivíduo. Faucher et al. ¹⁸ e Semmelhack e Wang ¹⁶ adaptada a configuração para monitorar as respostas olfativas de Drosophila individual. O olfactómetro de quatro quadrantes é igualmente sensível às respostas atractivas e repulsivas, permitindo uma vasta gama de condições de ensaio e odorantes. Software de rastreamento fly escrita por encomenda, desenvolvido por Alex Katsov ¹⁹ e atualmente mantido por Julian Brown (detalhado em Materiais), apresentou vantagens adicionais para implementações mais recentes do olfatômetro de quatro quadrantes ^14,20-23. É agora possível testar até 100 moscas simultaneamente em alta resolução espacial (27,5 pixels / cm) e temporais (30 quadros por segundo) de resolução, que permite extrair vários parâmetros, tais como posição, velocidade e aceleração de moscas em qualquer ponto do tempo. Isso permite que as investigações sobre a dinâmica das respostas comportamentais das moscas aos odores ²⁰ </s-se>. Deve notar-se, no entanto, que a identidade de moscas individuais dentro da população durante todo o período de seguimento não é mantido. Em vez disso, cada faixa mosca é registrado por até duas faixas mosca não se cruzam. Em que ponto, novas faixas são atribuídos após as moscas divergem. Ao incorporar outro software de captura de vídeo (detalhado na Tabela de Materiais), a mesma configuração permite períodos de monitoramento flexível e pode ser usado para controlar moscas por até 24 horas, tomando imagens a uma taxa de quadros mais baixa. Esta opção foi utilizada para estudar os comportamentos que põem ovos de moscas e comparar suas posições corporais com as preferências oviposição ^14. O olfactómetro de quatro campos podem também ser utilizados para estudar as respostas para multimodal (por exemplo, olfativas e visuais) estímulos, ou para combinar optogenetic ⁹ ou ²¹ termogênico estimulação com apresentações de estímulos sensoriais. Além disso, a resolução temporal alta permite que a extracção de trajectórias for cada mosca individual no conjunto de dados ensemble. Portanto, o método permite investigação sobre comportamentos da população olfativos-guiada e também interações sociais individuais. Os dados gerados por este ensaio são robustos e altamente reprodutível, que permite a utilização do olfactómetro de quatro campos para telas comportamentais.

Descrevemos aqui o conjunto de instalação para um olfatômetro de quatro quadrantes. Demonstramos ainda mais a sua utilização no ensaio de atração olfativa em resposta ao vinagre de maçã e repulsão em resposta ao propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, descreve-se e proporcionar o Exemplo de código para a análise dos dados de controlo de mosca gravados.