Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es un virus con envuelta que se reúne en los brotes y de la membrana plasmática (PM) en la mayoría de tipos de células. El montaje de VIH-1 partículas de virus está impulsado por la proteína del núcleo viral 55 kDa denominado Pr55 ^Gag (Gag). Gag se sintetiza como una poliproteína precursora compuesta de cuatro grandes dominios estructurales, a saber, matriz, la cápside, la nucleocápside, y p6, así como dos péptidos espaciadores SP1 y SP2. Durante el montaje, la matriz (MA) de dominio es responsable de la orientación de la mordaza para el lugar de montaje, la cápside (CA) de dominio media interacciones Gag-Gag, la nucleocápside (NC) de dominio recluta ARN genómico viral, y factores del huésped p6 reclutas que ayudan escisión de partícula de virus de la membrana plasmática. Gag también sufre una modificación co-traduccional por la adición de un ácido graso de 14 carbonos o resto miristato de en su extremo N-terminal.

unión de la mordaza de la membrana es un requisito esencial para el ensamblaje viral, ya que mutants que son defectuosos en la unión a la membrana no pueden producir partículas de virus. Nosotros y otros han demostrado que la unión de la mordaza está mediada por señales bipartitos dentro del dominio MA membrana: la fracción de miristato de N-terminal que media las interacciones hidrofóbicas con la bicapa de lípidos y un grupo de residuos básicos en el dominio MA denomina como región altamente básica ( HBR) que interactúa con los lípidos ácidos en el PM ^1-4. Los estudios de la mordaza de la membrana interacciones utilizando la expresión ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatasa IV (5ptaseIV), una enzima que cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositol fosfolípidos ácidos PM-específica (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P _2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, en las células sugiere que Gag-PM localización está mediada por PI (4,5) P ₂ ^3,5. Sin embargo, los estudios in vitro con el objetivo de comprender los detalles más mecanicistas de Gag-PI (4,5) _P2 interacciones han demostrado ser un reto para un número de razones. porejemplo, la purificación de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag para experimentos bioquímicos ha sido técnicamente difícil al menos en parte debido a la tendencia de la mordaza a agregarse durante la purificación. Por lo tanto, las formas truncadas de VIH-1 Gag, como Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma no myristoylated se han utilizado con frecuencia en los estudios que requieren la purificación de la mordaza (por ejemplo, resonancia magnética nuclear, la huella de la proteína, y la superficie resonancia de plasmón ^6-9). Alternativamente, acoplados jp reacciones de transcripción-traducción in vitro se han utilizado para producir de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag en otros estudios bioquímicos ^1,2. Típicamente, en este sistema, un plásmido Gag-codificación se transcribe y se traduce con lisados ​​de células eucariotas (por ejemplo, lisados ​​de reticulocitos de conejo) que están desprovistos de cualquier membranas celulares y ARN mensajeros, pero contienen la maquinaria para la transcripción y la traducción. Después de la reacción, los lisados ​​celulares que contienen Gag se mezclan con membranes para el análisis de las interacciones de la mordaza con los lípidos. Además de la facilidad de la preparación de longitud completa myristoylated Gag, los métodos que utilizan el sistema de traducción de la transcripción in vitro tienen una ventaja que la síntesis de Gag y reacciones de unión de membrana posterior se producen en un medio 'eucariota citosol-como "que pueden representar mejor las condiciones fisiológicas. Esta propiedad contribuyó a los estudios que mostraron que las moléculas de ARN unido al dominio MA regulan Gag unión a lípidos ácidas de manera competitiva ^1,2,10-12. Sin embargo, ya que la cantidad total de proteínas Gag obtenidos en estos lisados ​​celulares no son altos, marcaje metabólico de las proteínas con aminoácidos radiomarcados es necesaria para su detección.

Dependiendo del método para medir las interacciones Gag-lípidos, se han utilizado una variedad de preparaciones de membrana. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas y limitaciones. La mayoría de los ensayos basados ​​en RMN requieren el uso de lípidos con acilo cortocadenas que son solubles en agua (por ejemplo, C4 y C8-PI (4,5) _P2) ^6,8. Si bien los métodos de RMN de ensayo de fijación de la mordaza a los lípidos que tienen cadenas acilo largas que se encuentran en las células están siendo desarrollados, se han utilizado solamente con MA myristoylated o nonmyristoylated hasta ahora ^8,13. Alternativamente, los liposomas preparados a partir de lípidos que tienen cadenas de longitud de acilo nativos se han utilizado en los métodos bioquímicos tales como la flotación del liposoma o liposoma de bolas fluorescentes ensayos de unión ^{2,3,10,14-16.} Sin embargo, los liposomas usados ​​en estos ensayos tienen diámetros pequeños, y por lo tanto sus membranas tienen curvaturas pronunciadas y positivos. En contraste, durante la primera fase de ensamblaje de partículas en las células infectadas por VIH-1, Gag se une a la PM, que es casi plano sobre la escala de Gag, y posteriormente induce curvatura negativa durante ciernes. Por lo tanto, las membranas de liposomas con curvatura pronunciada y positivo podría no ser bicapas lipídicas ideales para estudiar las interacciones Gag-lípido. En cuanto a flot liposomaLos ensayos ación, otro posible advertencia es que la exposición de los complejos de lípidos a Gag-gradiente de sacarosa hipertónica durante la centrifugación pueden afectar el resultado experimental. Para aliviar estas limitaciones y proporcionar un sistema experimental complementaria, ensayos para la mordaza de unión a vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se han desarrollado en los últimos años. GUVs son vesículas bicapa de lípidos individuales cuyos diámetros extender a varias decenas de micrómetros. Por lo tanto, la curvatura de estas membranas se asemeja a la PM en la escala de Gag. Por otra parte, debido a su gran tamaño, lo que permite la inspección visual en los microscopios ópticos, membrana de unión a proteínas Gag de fluorescencia etiquetados o marcados para estas vesículas después de la mezcla puede determinarse fácilmente sin el tratamiento posterior de los complejos de la mordaza en lípidos.

Se describen un protocolo para el estudio del VIH-1 de unión utilizando GUVs obtenidos a partir de un método electroformation membrana de la mordaza. Diversos métodos tales como la hidratación suave, gel de hidratación asistida, micrófonochorro rofluidic, y electroformation ^17-22 se han utilizado para obtener GUVs. Para el protocolo descrito aquí, el método electroformation se usa principalmente debido a su eficiencia en la formación de GUVs con los lípidos ácidos y su relativa facilidad de uso sin la necesidad de configuraciones de caras. Desde la visualización de Gag requiere un indicador fluorescente, amarillo proteína fluorescente (YFP) se añade genéticamente a la C-terminal de Gag (Gag-YFP). Proteínas Gag-YFP se obtienen in vitro de transcripción y traducción reacciones jp trigo en lisados ​​de germen basado en la tecnología continua de cambio de flujo continuo (CECF). En esta tecnología, tanto la eliminación de subproductos inhibidores de las reacciones y de suministro de sustratos de reacción y componentes de energía se consigue en un mecanismo basado en diálisis. Para estas reacciones, se utiliza un plásmido que codifica Gag-YFP bajo el control de un promotor T7. Es de destacar que, como se ha mostrado anteriormente, lisados ​​de germen de trigo apoyan miristoilación sin componentes adicionales ²3,24. Usando este método, ha sido posible obtener cantidades suficientes de longitud completa myristoylated Gag-YFP para la visualización de la mordaza sobre las membranas GUV ^24. A continuación se describe el protocolo con el que el VIH-1 Gag unión a PI (4,5) _P2 -Con membranas GUV puede ser examinado sin un procesamiento más largo subsecuente siguiendo reacciones de unión y proponer que este método complementa preexistente Gag-membrana ensayos de unión y puede ser extendido para comprender mejor el VIH-1 Gag-membrana de unión.