Genetische en biochemische benaderingen voor<em> In Vivo</em> en<em> In Vitro</em> Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

1. Gist twee-hybride gist Transformatie Bereid de volgende media en buffers: Bereid gist volledige gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium door mengen van 20 g / l pepton, 10 g / l gistextract, 2% w / v glucose (toegevoegd na autoclavering) en 20 g / l agar (voor platen) met ; steriliseer in de autoclaaf en het gebruik van vers op de dag van het experiment. Bereid gist minimaal synthetisch gedefinieerd (SD) medium (ontbreekt leucine en tryptofaan selectieve druk op beide aas en doel plasmiden te houden) door mengen van 6,7 g / l giststikstofbase, 1,6 g / l wegfilteren supplement ontbreekt leucine en tryptofaan, 2% w / v glucose (toegevoegd na autoclavering) en 20 g / l agar (voor platen alleen); steriliseer in de autoclaaf en het gebruik van vers op de dag van het experiment. Bereid 50% w / v PEG (polyethyleenglycol) 3350; steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur. Bereid 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), aan te passende pH op 7,5, steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur. Bereid 1 M lithium acetaat (10x LiAc); breng de pH op 7,5 met CH3COOH, steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur. Revive de Y2H stam (bijv Y190) door uitstrijken een kleine hoeveelheid van de bevroren glycerol voorraad op een YPD plaat. Incubeer bij 30 ° C tot gistkolonies bereikt ~ 2 mm in diameter (gewoonlijk 3-5 dagen, afhankelijk van de giststam). Inoculeer 0,5 ml YPD (in een 1,5 ml tube) met een enkele, grote (2-3 mm in diameter) kolonie. Vortex krachtig gedurende ~ 2 minuten om eventuele klonten verspreiden. Transfer celsuspensie in een kolf van 500 ml met 50 ml YPD medium. Incubeer bij 30 ° C gedurende 16-18 uur onder schudden bij 250 rpm gist stationaire fase bereikt. Transfer 4-5 ml van de overnacht cultuur in 200 ml YPD (in een 1 L erlenmeyer) tot een optische dichtheid bij 600 nm te produceren (OD 600, gemetenonder toepassing van een spectrofotometer) van 0,2-0,3 (200 ml is voldoende voor 20 transformaties). Incubeer bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm tot cellen in mid-log fase, dwz OD 600 = 0,5-0,6 (gewoonlijk 2-3 uur). Gist oogst door centrifugatie (in 50 ml buizen) en 1500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer elke pellet in 5 ml steriele H 2 O en zwembad samen. Re-centrifuge bij 1500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant. Resuspendeer gist pellet in 1 ml vers bereid, steriel 1x LiAc / TE. OPMERKING: Gebruik bevoegde gistcellen binnen 1 uur van voorbereiding. Bereid plasmide monsters (in 1,5 ml buizen) door toevoeging van 200 ng plasmide-DNA voor interne transformaties of 0,5-1 ug van elk plasmide DNA voor co-transformaties, en 100 ug haring testes carrier DNA (gekookt gedurende 20 min en afgekoeld op ijs juist voor gebruik). OPMERKING: Neem een positieve controle, bijvoorbeeld gist.Co-getransformeerd met pVA3 (coderend voor het GAL4 DNA-BD fusie met p53 eiwit) en pTD1 (codering voor GAL4 AD fusie met SV40 grote T antigen). Voeg 100 ul van de vers bereide, competent gistsuspensie (stap 1.1.8) en 600 ul van 1x LiAc / PEG-oplossing (8 ml van de PEG 3350, 1 ml van de TE, 1 ml voorraad LiAc) en vortex voor ~ 30 sec. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten onder schudden bij 200 rpm. Voeg 80 pl dimethylsulfoxide (10% v / v eindconcentratie) en meng door voorzichtig omkeren. Heat shock gedurende 15 min in een 42 ° C waterbad onder mengen elke 2-3 min. Chill celsuspensie op ijs gedurende 2 minuten en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 sec bij KT om gist te herstellen. Resuspendeer de cel pellet in 100 ul 1x TE en plaat op geschikte minimale SD medium platen voor selectieve groei (medium zonder leucine en tryptofaan aan selectieve druk op zowel aas en target plasmiden te houden). Incubeer de platen up-side-down op 30° C totdat kolonies ~ 2 mm (gewoonlijk 4-5 dagen). Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2-3 weken; voor langere opslag te maken glycerol voorraden en bewaar bij -80 ° C. OPMERKING: Controleer of aas en doeleiwitten worden tot expressie gebracht in gist door immunoblotting 17, en dat ze niet autonoom reportergen activatie wanneer afzonderlijk tot expressie gebracht in gist (door β-Gal assay zoals beschreven in paragraaf 1.3). Kolonie-lift Filter Paper β-Gal Assay Bereid de volgende buffers: Bereid Z buffer die 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; breng de pH op 7,4. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. Bereid X-gal buffer door oplossen van 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside aan 20 mg / ml in N, N-dimethylformamide en bewaar in het donker bij -20 ° C. Bereid Z buffer / X-Gal oplossing. maak buffervoor gebruik door het mengen van X-gal aan 0,33 mg / ml en β-mercaptoethanol bij 0,27% v / v in Z-buffer. Gebruik 2,5 ml per monster. Voeg 2,5 ml vers bereide Z buffer / X-Gal oplossing in een schone 100 mm plaat en plaats in een cellulose filter papier. Plaats een nieuw filterpapier op het oppervlak van de plaat met de gist kolonies te testen. Wrijf het filter papier op de plaat met een tang en laat ~ 5 min voor kolonies te bevestigen. NB: Verwerk de positieve controle in parallel, dat wil zeggen, gist co-getransformeerd met pVA3 en pTD1.. Til het filter papier en onderdompelen (met een pincet) in een pool van vloeibare stikstof gedurende 30 seconden (vloeibare stikstof moet met zorg worden behandeld; Draag altijd dikke handschoenen en een veiligheidsbril). Laat de bevroren filterpapier dooi bij kamertemperatuur gedurende ~ 2 min. Breng het filter (kolonie kant naar boven) bovenop de geweekte filterpapier in de 100 mm plaat en incubeer bij 30 ° C. controleer regelmatig(Elk ~ 30 min) voor het verschijnen van blauwe kolonies. Gist Y190 co-getransformeerd met de positieve controle plasmiden (pVA3 + pTD1) zal blauw binnen 60 min (niet gepubliceerde waarnemingen) draaien. LET OP: Zwak aas: target interacties kan enkele uren duren om een ​​positief signaal te produceren blauw (vermijd langdurige incubatie (> 8 uur), die vals-positieve resultaten kunnen geven). Voor het beste resultaat, gebruik vers mede-getransformeerde kolonies, dat wil zeggen, gegroeid bij 30 ° C gedurende 4 -. 5 dagen, ~ 2 mm in diameter. Liquid Culture β-Gal Assay Bereid de volgende buffers: Bereid Z buffer die 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; breng de pH op 7,4, steriliseer in de autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. 1 M Na 2 CO 3; bewaar bij kamertemperatuur. Bereid Z buffer / β-mercaptoethanol. Voeg buffer voor gebruik door het toevoegen van β-mercaptoethanol at% 0,27 v /v Z buffer; Gebruik 700 ul per monster. Bereid Z buffer / ONPG oplossing. Voeg buffer voor gebruik door het mengen van ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside) en 4 mg / ml en β-mercaptoethanol bij 0,27% v / v in Z-buffer; Gebruik 160 ul per monster. Gebruik een kolonie 5 ml minimaal SD inoculeren (leucine en tryptofaan ontbrak selectieve druk op beide aas en doel plasmiden te houden) en incubeer bij 30 ° C gedurende 16-18 uur onder schudden bij 250 rpm. LET OP: Assay vijf afzonderlijke kolonies co-getransformeerd met hetzelfde aas en target plasmiden. Transfer genoeg van de overnacht cultuur in 10 ml vers SD-medium tot een OD 600 = 0,2 produceren – 0,3. Incubeer bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm tot de cellen in mid-log fase (OD 600 = 0,5-0,6). Transfer 0,5 ml gistcultuur in een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Noteer de exacte OD 600 bij het ​​oogsten van de ceLLS. Resuspendeer pellet in 100 ui buffer Z; Dit resulteert in een 5-voudige concentratiefactor. Plaats de buis in vloeibare stikstof voor ~ 1 min (vloeibare stikstof moet met zorg worden behandeld; Draag altijd dikke handschoenen en een veiligheidsbril) en vervolgens in een 37 ° C waterbad gedurende 3 minuten te ontdooien. Herhaal deze vries-dooi cyclus tweemaal te verzekeren cellen opengebroken. Stel een lege buis met 100 ui buffer Z. Voeg 700 ul van buffer Z / β-mercaptoethanol en 160 pl buffer Z / ONPG het monster en blanco buizen; start de timer en plaats in een 30 ° C incubator. Controleer regelmatig voor de gele kleur te ontwikkelen. Voeg 400 ul van 1 M Na 2 CO 3 kleurontwikkeling te stoppen en de verstreken tijd te registreren in minuten. Gist Y190 co-getransformeerd met de positieve controle plasmiden (pVA3 + pTD1) wordt geel binnen 60 min .. OPMERKING: Zwak aas: target interacties kan enkele uren duren om een ​​positief signaal geel Voor de beste re producerensultaten Gebruik vers co-getransformeerde kolonies, dwz, gekweekt bij 30 ° C gedurende 4 -. 5 dagen, ~ 2 mm in diameter. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur celresten pellet en breng het supernatans in een schone cuvet. Gebruik van een spectrofotometer meet de absorptie bij 420 nm (420 A) van de monsters ten opzichte van de blanco (waarden moet tussen 0,02-1,0). Bereken β-galactosidase eenheden, waarbij 1 eenheid gedefinieerd als de hoeveelheid die 1 umol hydrolyseert ONPG tot o-nitrofenol en D-galactose per minuut per cel, volgens de volgende formule: = Β-galactosidase eenheden Waar: t: verstreken tijd van de incubatie (in minuten); . cf: de concentratiefactor uit stap 1.4.8, dwz cf = 5; OD 600: wanneer de cellen werden geoogst. 2. eiwitexpressie in een zoogdiercellijn <strong> Mammalian Cell Transfectie Bereid de volgende media en buffers: Bereid groeimedium door mengen DMEM met 4,5 g / l glucose, 10% v / v foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine; steriliseer door een 0,2 um filter en bewaar bij 4 ° C. Bereid 2x Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS 2x) door mengen van 280 mM NaCl, 10 mM KCI, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM glucose, 50 mM Hepes; op pH 7,05, steriliseer door een 0,2 um filter en bewaar bij -20 ° C. Bereid 2,5 M CaCl 2. Sterilisatie door een 0,2 um filter en bewaar bij -20 ° C. Eén dag voor transfectie, zaad 1-2 x 10 6 HEK293 cellen in een 100 mm petrischaal om 60-70% confluent de volgende dag. Kweek gedurende 16-18 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Op de dag van de transfectie, verwijder de oude medium en diervoeders cellen met 10 ml vers groeimedium. NOTITIEAntibiotica worden weggelaten uit het kweekmedium tijdens transfectie omdat celdood verhogen. Verdun 24 ug plasmide DNA (voor co-transfecties gelijke molaire verhouding van de twee plasmiden) en 60 pl 2,5 M CaCl2 in 600 ui totaal volume (gemaakt met steriel gedeïoniseerd H 2 O) in een 1,5 ml buis; vortex te mengen. Opmerking. Voor de hoogste transfectie efficiëntie moet plasmide-DNA van de hoogste zuiverheid, dat wil zeggen, een Abs 260/280-verhouding Abs = ~ 1,8. Voeg het plasmide DNA / calcium oplossing druppelsgewijs in een 50 ml buis met 600 ui 2x HBS onder voortdurend en krachtig mengen door vortexen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van calciumfosfaat / plasmide-DNA-complexen mogelijk maken. Na 20 min incubatie vortex kort wijze voeg de oplossing vallen op de cellen om het gehele oppervlak van de 100 mm petrischaal dekken. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO <sub> 2. Na ~ 6 uur verandert het groeimedium en plaats terug in de incubator. Oogst de cellen 24 uur na transfectie door centrifugatie bij 1000 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur Verwijder de bovenstaande vloeistof. Celpellets worden opgeslagen bij -80 ° C totdat het nodig is. LET OP: Expression pieken meestal 24-72 uur na transfectie. Cell homogenisering Bereid de volgende buffers: Bereid Co-IP homogenisatie buffer door het mengen van 150 mM NaCl, 20 mM Tris; breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C. Bereid Verknoping homogenisatiebuffer door 5 mM Hepes, 0,3 M sucrose; breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C (filter voor gebruik om alle deeltjes te verwijderen). Aangevuld met proteaseremmers voor gebruik. Voeg 250 ul van glasparels (425-600 micrometer) in een 1,5 ml buis en wassen met 500 pl homogenisatiebuffer. Pellet glasparels door een korte centrifugerenpuls (1000 g gedurende 5 sec) en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap eens te meer. Resuspendeer celpellet (uit stap 2.1.8) in 500 pl ijskoude homogenisatiebuffer en breng de celsuspensie in de glasparels bevattende buis. Homogeniseer cellen op ijs door 20 doorgangen door een fijne naald (23 G, 0,6 x 30 mm) bevestigd aan een 1 ml spuit. Met de buis kap gesloten, doorboren met de naald en verspreiden celsuspensie krachtig door de glazen kralen. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om kernen en niet gebroken cellen te verwijderen en gooi de pellet. Sla de supernatant die de post-nucleaire fractie en ga direct naar co-IP of cross-linking naargelang het geval. 3. In vitro biochemische methoden Co-immunoprecipitatie Bereid de volgende buffers: Bereid Co-IP homogenisatiebuffer zoals beschreven in seel 2.2.1.1. Bereid IP buffer door het mengen van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% (w / v) CHAPS, 2 mM dithiothreïtol (optioneel, dithiothreitol kunnen eiwit aggregaten die kunnen gevormd door luchtoxidatie dalen); breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C. Bereid 2% w / v CHAPS in co-IP homogenisatiebuffer; bewaren bij 4 ° C. Bereid Eiwit-laadbuffer door het mengen van 60 mM Tris, 2% w / v SDS, 10% v / v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% w / v broomfenolblauw, 2% v / v β-mercaptoethanol (optioneel); breng de pH op 6,8 en bewaar bij kamertemperatuur. Homogeniseren van de cellen van een confluente 100 mm petrischaal (~ 8 x 10 6 cellen of HEK293, geteld met behulp van een hemocytometer) zoals beschreven in paragraaf 2.2. Oplosbaar de post-nucleaire subcellulaire fractie met 0,5% CHAPS (met de 2% voorraad) en incubatie gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de onoplosbare materialen te pelleterenal en gooi de pellet. Sla het bovenstaande genoemd cellysaat. OPMERKING: De opname van een detergens en het verwijderen van het onoplosbare materiaal absoluut noodzakelijk te minimaliseren aspecifieke binding. . Tussenproduct wasmiddelen, bijvoorbeeld CHAPS of Triton X-100 in een concentratie van 0,2-1%, zijn de meest gebruikte. Bereid twee afzonderlijke 1,5 ml buisjes en voeg 20 ul ~ (afhankelijk IgG bindingsvermogen) van 6 mg / ml proteïne-A of proteïne-G agarose (of sepharose) korrels. Wassen met 200 pl IP buffer. OPMERKING: Kies de juiste Ig-bindend hars afhankelijk van de diersoort die de immunoprecipitatie antilichaam verhogen. Proteïne-G bindt een breder Ig subtypen vergelijking met proteïne-A. Herstel kralen door centrifugering bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal wassen opnieuw met IP buffer, daarna resuspendeer kralen in 200 ul IP buffer. Voeg 1 ug (5 ng / pl) van de immunoprecipitatie antilichaam of niet-immune IgG (naardienen als negatieve controle) in de twee verschillende proteïne-A / G bevattende buizen. Incubeer gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen. OPMERKING: Altijd verwerken negatieve controle met het gebruik van niet-immune IgG opgewekt in dezelfde diersoort als de immunoprecipitatie antilichaam. Herstel kralen door centrifugering bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C en voorzichtig het supernatant door pipetteren ontdoen. Transfer 200 ul cellysaat (uit stap 3.1.3) in elk van de twee buizen met antilichaam en Proteïne-A / G kralen. Incubeer gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen om voor antigeen-antilichaambinding. Herstellen kralen en wassen met 200 ui buffer IP; Incubeer 10 min bij 4 ° C onder mengen. Herstellen kralen en was tweemaal (vaak meerdere wasbeurten die zowel specifieke en niet-specifieke binding te verminderen). gooi voorzichtig het supernatant door pipetteren. Voeg 30 ul proteïne-laadbuffer elueren immunoprecipitated eiwitten. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder de kralen en bewaar de bovenstaande vloeistof die het geëlueerde co-IP monster. Om succesvol eiwit X precipitatie verifiëren, laadt een kleine hoeveelheid (1/10, 3 ul) van de co-IP monster op een SDS-PAGE gel te worden geanalyseerd door immunoblotting met 17 antilichaam specifiek voor proteïne X. Neem een monster van de cellysaat eiwit X expressie te controleren in je steekproef. Om te testen op de aanwezigheid van co-geprecipiteerd eiwit Y, laadt de rest (9/10 th, 27 pl) van de co-IP monster op een aparte SDS-PAGE-gel worden geanalyseerd door immunoblotting met antilichaam specifiek 17 voor eiwit Y. omvatten een monster van het cellysaat eiwit Y verificatie van expressie in de steekproef. Chemische verknoping Bereid de volgende buffers: Verknoping homogenisatiebuffer zoals beschreven in paragraaf 2.2.1.1. Bereid 5x pProtein-laadbuffer door het mengen van 300 mM Tris, 10% w / v SDS, 50% v / v glycerol, 25 mM EDTA, 0,05% w / v broomfenolblauw, 10% v / v β-mercaptoethanol (optioneel); breng de pH op 6,8 en bewaar bij kamertemperatuur; verwarm bij 50 ° C vóór gebruik. Homogeniseren van de cellen van een confluente 100 mm petrischaal (~ 8 x 10 6 cellen of HEK293, geteld met behulp van een hemocytometer) zoals beschreven in paragraaf 2.2. OPMERKING: Sucrose (at 0,3M) wordt gebruikt om een ​​iso-osmotische buffer te creëren. Zout, bijvoorbeeld 120-150 mM NaCl of KCl kan worden gebruikt, maar afhankelijk van het oligomeer eiwitcomplex plaats. Centrifugeer de post-nucleaire subcellulaire fractie bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet proteïneaggregaten en bewaar het supernatant. Neem acht monsters van 20 pl elk (meestal ~ 20 ug eiwit) in afzonderlijke 0,5 ml buizen. Voeg 0,0025% v / v glutaaraldehyde alle monsters en start de timer. Laat elk van de acht monsters reageren met glutaraldehyde bij KT: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min. LET OP: Glutaraldehyd heeft twee aldehydegroepen die reageren met vrije aminen. Gebruik geen pH buffers of andere stoffen met primaire aminogroepen omdat glutaaraldehyd reactie zal doven. Stop glutaaraldehyde reactie op de aangegeven tijd met 2% v / v hydrazine en voeg 5 pl 5x eiwit-laadbuffer eiwitten denatureren. Ga verder met SDS-PAGE en immunoblotting 17.