Ein detailliertes Protokoll der murinen C1498-Zelllinie und der damit verbundenen Leukämie Maus-Modell für Charakterisieren
概要
Diese Handschrift stellt ein technisches Verfahren , das verwendet werden kann , C1498 – Zellkulturen in vitro und der akuten Leukämie induziert in Mäusen nach der Injektion zu charakterisieren. Die phänotypische und funktionelle Analysen werden mit Hilfe der Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzmikroskopie, Zytochemie und May-Grünwald Giemsa Färbung durchgeführt.
Abstract
Die intravenöse Injektion von C1498-Zellen in syngene oder kongenen Mäusen durchgeführt worden ist seit 1941. Diese Injektionen in der Entwicklung von akuter Leukämie führen. Allerdings hat die Natur dieser Krankheit nicht gut sind in der Literatur dokumentiert. Hier stellen wir ein technisches Protokoll für die Charakterisierung von C1498 – Zellen in vitro und für die Art der induzierten Leukämie in vivo zu bestimmen. Der erste Teil dieses Verfahrens ist, fokussiert die hämatopoetischen Abstammungslinie und dem Stadium der Differenzierung von kultivierten C1498-Zellen auf der Bestimmung. Um dies zu erreichen, wird multi-parametrischer durchflusszytometrische Färbung verwendet, um hämatopoetische Zellmarker erkennen. Immunofluoreszenz-Mikroskopie, Zytochemie und einer May-Grünwald-Giemsa-Färbung werden dann durchgeführt, um die Expression von Myeloperoxidase zu beurteilen, die Aktivität von Esterasen und zellulärer Morphologie, respectively. Der zweite Teil dieses Protokolls wird auf die Beschreibung der Leukämieerkrankung gewidmet , die で induziert wirdvivo. Letzteres kann durch die Bestimmung der Frequenzen von leukämischen und inhärenten Zellen im Blut, hämatopoetischen Organe (zB Knochenmark und Milz) und nicht-lymphoiden Geweben (zB Leber und Lunge) unter Verwendung spezifischer Färbung und Durchflusszytometrie – Analysen erreicht werden. Die Art der Leukämie bestätigt dann in dem Knochenmark für spezifische Esterasen May-Grünwald-Giemsa-Färbung und Färbung verwendet wird. Hier präsentieren wir die Ergebnisse, die erhalten wurden unter Verwendung dieses Protokolls in altersangepassten C1498- und PBS-injizierten Mäusen.
Introduction
Akute myeloische Leukämie (AML) durch die unkontrollierte Proliferation von hämatopoetischen myeloischen Zellen charakterisiert, die in verschiedenen Stadien der Reifung blockiert sind. Diese Dysregulation kann Einfluss auf die granulocytic, monozytären, erythrozytische oder megaryocytic Differenzierungswege 1. AML-Zellen reichern sich im Knochenmark, zu einer Beeinträchtigung der Hämatopoese führt, die in Thrombopenie, Lymphopenie und Anämie führt. Die leukämischen Zellen dringen auch das Blut und nicht-lymphatischen Organen.
Die C1498 – Maus – Modell wird seit Jahrzehnten als Modell für akute Leukämie , da Krebszellen wurden isoliert aus einer leukämischen 10 Monate alte C57BL / 6 (H-2 b) weibliche Maus in 1941. In der Literatur wird die Invasion in das Blut verwendet hämatopoetische Organe (zB die Milz und Lymphknoten) und nicht-hämatopoetischen Organen (beispielsweise der Leber, Lunge, Ovarien und Nieren) durch stark proliferative C1498 – Zellen , nachdem sie wurden über eine in injizierteintravenöse, subkutane oder intraperitoneale Route in empfängliche Mäuse 2-4. Allerdings wurde diese Maus – Modell berichtet entweder granulocytic 2,5 oder myelomonocytic 6 Leukämie zu induzieren. In jüngerer Zeit 7 beschrieben , diese Art von Krebs als murine NKT – Zell – Leukämie eine Studie in 2002 veröffentlicht. Somit unterscheidet sich die Literatur die Natur dieser Zellinie C1498 betreffend und die zugehörige Leukämie in Mäusen induziert. Diese Diskrepanzen sind vor allem auf einen Mangel an detaillierten und aktualisierten veröffentlichten Informationen über die Zellen und die leukämische Erkrankung im Allgemeinen, weil viele Studien in den 1950er Jahren durchgeführt wurden – 70er Jahre.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zu beschreiben, wie C1498-Zellen zu charakterisieren und die Art der leukämischen Krankheit zu analysieren, die durch die intravenöse Injektion in Mäuse induziert wird. Der erste Abschnitt dieses Protokolls wird auf eine Beschreibung der C1498 – Zellen gewidmet , die in vitro kultiviert wurden. Fluorescent Antiunter Verwendung von Durchflusszytometrie gerichtet Körper gegen die Oberfläche und die intrazelluläre wurden hämatopoetischen Marker verwendet ihren Phänotyp zu bestimmen. Die Anwesenheit von Myeloperoxidase beurteilt wurde Immunfluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung ihrer hämatopoetischen Abstammungslinie und Differenzierungsstadium wurden mit Zytochemie ausgewertet, die Aktivität von Esterasen zu bewerten und May-Grünwald-Giemsa-Färbung wurde durchgeführt. Die C1498-Zellen wurden dann in Mäuse injiziert und die akute Leukämie Krankheit, die induziert wurde, ist in dem zweiten Abschnitt des Manuskripts beschrieben. Die gleichen Techniken wurden verwendet, um die Frequenzen zu bestimmen und die Phänotypen von leukämischen und inhärenten Zellen im Knochenmark, peripherem Blut, Milz und nicht-hämatopoetischen Organen (Leber und Lunge).
Dieses Protokoll ist in hohem Maße reproduzierbar, und die hier vorgestellten Daten werden Forschern helfen, die Auswirkungen von neuen therapeutischen Strategien zu bewerten. Diese Leukämie-Maus-Modell wurde bereits für die Immuntherapie zu testen, nähert sich einnd verschiedenen Krebschemotherapeutika 8,9. Ihre Wirksamkeit wurde durch die Bestimmung der Entwicklung der Tumorlast und Überlebensraten beurteilt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, zusätzliche Informationen über die Verteilung zur Verfügung zu stellen und Aufenthaltskosten von leukämischen und anderen hämatopoetischen Zellpopulationen während der Behandlung.
Protocol
Tiergehäuse und alle experimentellen Verfahren wurden von der lokalen Animal Care Ethikkommission, CEEA.NPDC (Vereinbarung no.512012) genehmigt, und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Französisch und europäischen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. 1. In vitro Charakterisierung der Zelllinie C1498 In vitro – Kultur von C1498 – Zellen Bereiten komplettem RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium mit 50 ml fötalem Rinderserum (FBS) Zugabe wurden 5 ml Penicillin (100 U / ml) -streptomycin (100 ug / ml), 500 ul 50 mM β-Mercaptoethanol 5 ml N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 ml von nicht-essentiellen Aminosäuren und 5 ml Natriumpyruvat in 500 ml RPMI-Medium. Wachsen die C1498-Zelllinie in komplettem RPMI. Ernten Sie die Zellen in Suspension durch Pipettieren, und übertragen Sie die Zellen in einen 50-ml-Tube. Zentrifuge bei 350 × g für 10 min, und entfernen Sie die supernatant. 20 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (1x) Lösung Zentrifuge bei 350 × g für 10 min, und der Überstand entfernt. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS) Puffer (2,5 g Rinderserumalbumin (BSA) Pulver und 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung in 500 ml PBS-Lösung). Zählen Sie die Zellen einer Thoma-Zelle mit Zählkammer nach der Zellen mit Trypan-Blau-Färbung. Phänotypischen Charakterisierung der C1498-Zelllinie unter Verwendung von Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse Zeiloberflächenfärbung Bereiten Sie FACS-Puffer. Stellen Sie die geernteten Zellen in FACS Puffer auf 10 7 Zellen / ml und abzugeben ; 10 6 Zellen (in 100 & mgr; l) für jedes Färbungs experiment in Durchflusszytometrie Rohre. Beschriften der Zellen mit 100 & mgr; l der folgenden Antikörper oder deren zugehörigen Isotypkontrollen verdünnt in FACS-Puffer: Bildenarkers des Vorläufers und differenzierten Zellen, um die Zellen mit anti-CD11b / anti-CD18 (1), anti-Ly-6G (1), anti-CD19, anti-B220 (2) kennzeichnen, anti-NK1.1, anti- CD49b, anti-CD4 (1), anti-CD8 (2), anti-CD3 (3), anti-CD21 / 35, Anti-CD115 und anti-TCRVβ Antikörper. Für hämatopoetische Stammzellen / Vorläuferzellen-Marker, verwenden eine Kombination von anti-CD34 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD150 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD117 / anti-CD127 oder anti- CD16 / 32-Biotin-Antikörper allein. Für Marker der Zellfunktionen (beispielsweise Adhäsion, Antigenpräsentation, co-stimulatorische Moleküle und Rezeptoren), beflecken die Zellen mit anti-CD18 (2) / anti-CD11a, anti-MHC – Klasse – I, Anti-MHC – Klasse II, anti- CD31, anti-CD44, anti-CD80-Biotin, Anti-CD86 und anti-CD274-Antikörper. Inkubieren alle der Durchflusszytometrie Röhrchen bei 4 ° C für 30 min. Wasche die Zellen zweimal durch Zugabe von 2 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen, Zentrifuge bei 350 × g für 5 min, und der Überstand entfernt. </li> Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer zu jedem Röhrchen und gehen durch zur sekundären Anfärbung Zugabe von 100 ul Streptavidin fluoreszierend (1/100 in FACS-Puffer für eine Endverdünnung von 1/200) an die biotinylierte-konjugierten Antikörper. Inkubieren der Röhrchen bei 4 ° C für 30 min. Waschen Sie die zweimal Zellen wie folgt: 2 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen, Zentrifuge die Röhrchen bei 350 xg für 5 min, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Resuspendieren der Zellen in 500 & mgr; l kaltem PBS und legen Sie die Zellen auf Eis, so dass sie im Dunkeln zu halten durch Aluminiumfolie mit den Rohren zu decken. Analysieren Sie die Resultate mit einem Zytometer 10. intrazellulärer Färbung Vorbereitung Fixierungspuffer durch Zugabe von 125 ml einer 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung zu 375 ml PBS-Lösung. HINWEIS: Zu 500 ml 4% PFA, Wärme 400 ml PBS-Lösung auf etwa 60 ° C auf einer Rührplatte in einem belüfteten Haube vorzubereiten. In 20 g PFA-Pulver und erhöhen den pH-Wertbis die PFA gelöst. Lassen Sie die Lösung abkühlen, den pH-Wert auf 6,9, und das Volumen auf 500 ml mit PBS bilden. Bereiten Sie die Permeabilisierung Puffer durch Zugabe von 0,5 g Saponin und 0,5 g BSA in 500 ml PBS-Lösung. Stellen Sie die geernteten Zellen in FACS Puffer auf 10 7 Zellen / ml und 10 verteilen 6 der Zellen (100 & mgr; l) für jedes Färbungs experiment in Durchflusszytometrie Rohre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 xg für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Fixieren Sie die Zellen in 200 ul 1% PFA-Lösung und Inkubation bei 4 ° C für 10 min. 2 ml Permeabilisierung Puffer in jedes Röhrchen, Zentrifuge die Röhrchen bei 350 xg für 5 min, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Füge 100 & mgr; l Puffer durchdringbar zu jedem Röhrchen. Beschriften der Zellen mit 100 & mgr; l der folgenden Antikörper oder deren entsprechenden Isotypkontrollen nach Verdünnen sie in Permeabilisierung Puffer: anti-CD3 (2) / anti-CD8 (1), anti-CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), anti-CD107b und anti-CD3 (3) / anti-TCRVβ. Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 30 min. Wasche die Zellen zweimal durch Zugabe von 2 ml Permeabilisierung Puffer zu jedem Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 xg für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Füge 100 & mgr; l Puffer Permeabilisierung der Zellen. Fahren Sie mit sekundären Färbung durch Zugabe von 100 & mgr; l von fluoreszierenden Streptavidin verdünnt in Permeabilisierung Puffer auf biotinylierte-konjugierte Antikörper. Inkubieren der Röhrchen bei 4 ° C für 30 min. 2 ml Permeabilisierung Puffer in jedes Röhrchen, Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 xg für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Resuspendieren der Zellen in 500 & mgr; l kaltem PBS, und legen dann die Zellen auf Eis in der Dunkelheit. Analysieren Sie die Ergebnisse ein Durchflusszytometer 10 verwendet wird . Herstellung einer Zellsuspension auf Objektträger für die Mikroskopie Wash 10 6 des harvested C1498-Zellen (erhalten in Schritt 1.1.4) mit 5 ml kaltem FACs zweimal Puffer und die Zellen in 1 ml kaltem FACS-Puffer verdünnen. Die Röhrchen auf Eis. Legen Sie Dias in Einwegkammern mit vormontierter Filterkarten und legen Sie diese in ein Zytozentrifuge. Füge 100 & mgr; l FACS-Puffer zu jeder Kammer und Filterkarte, und Spin sie 2 min bei 4,52 x g. 100 l Zellen zu jeder Kammer und Filterkarte, und drehen Sie die Zellen bei 4,52 g für 2 min. Entfernen Sie vorsichtig die Folien aus den Kammern und an der Luft trocknen die Folien vor ihnen mit Myeloperoxidase (Schritt 1.4), Esterasen (Schritt 1.5) oder May-Grünwald Giemsa (Schritt 1.6) Färbung. Myeloperoxidase Färbung für Immunofluoreszenz Befestigen Sie die Zellen auf den Folien durch die Folien in einem kalten Methanol getaucht: Aceton (1: 1) Lösung für 2 min, und dann an der Luft trocknen die Folien. Um die Flüssigkeit in den Bereich des Schiebers darauf beschränken, die Zellen enthält, ein ci zeichnenrcle um die Herstellung eines wasserabweisenden Stift unter Verwendung von Zellen. Spülen Sie die Zellen in 200 ul kaltem PBS-Lösung für 10 min. Blockieren die Zellen in 200 ul 3% BSA / PBS Puffer, der 10 & mgr; l normalem Eselserum und 10 ug / ml gereinigtem anti-CD16 / 32-Antikörper. Gelten 200 ul des anti-Maus-Myeloperoxidase (verdünnt auf 20 ug / ml in 3% BSA / PBS-Puffer). Inkubieren Sie die Zellen O / N bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. Waschen Sie die Zellen mit 200 ul kalter 0,1% BSA / PBS. Bewerben 200 ul Anti-Ziege-IgG-Antikörper bei 1/250 in 3% BSA verdünnt / PBS-Puffer. Inkubieren der Zellen für 2 h bei RT in einer feuchten Kammer. Waschen Sie die Zellen 3-mal mit 200 ul 0,1% BSA / PBS-Puffer und zweimal in kaltem PBS. Beflecken die Zellkerne mit 200 & mgr; l Hoechst verdünnt auf 1 / 1.000 in PBS (bis zu einer Endkonzentration bei 1 ug / ml) für 2 min bei RT. Waschen Sie die Folien mit Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen, bevor mountinG. Einen Tropfen des Mediums 1 zu den Zellen der Montage mit einer Kante eines Deckglas auf den Objektträger und vorsichtig absenken auf die Zellen mit einer Pinzette. Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um Luftblasen zu entfernen. Esterase Zytochemie Hinweis: vorwärmen alle Reagenzien auf RT. Fixative Vorbereitung Um das Citrat-Aceton-Formaldehyd (CAF) Lösung zuzubereiten, 2,5 ml Citratlösung, 6,5 ml Aceton und 0,8 ml 37% Formaldehyd zu einer Glasflasche. Vorsichtig mischen und bei 4 ° C. Naphthol AS-D-Chloracetat-Esterase (CAE) Aktivitätstest Warm deionisiertem Wasser auf 37 ° C. In einem 50-ml-Röhrchen, 1 ml Natriumnitrit-Lösung zu 1 ml Farbstofflösung. Vorsichtig mischen und lassen Sie sich für 2 min stehen. 40 ml vorgewärmtes entionisiertes Wasser, 5 ml pH 6,3 Pufferkonzentrat und 1 ml Naphthol AS-D-Chloracetat Lösung. Mischen und Überführung in eine Coplin-Gefäß. Befestigen Sie die Zellen auf dieFolien für 30 Sekunden mit CAF-Lösung (siehe Schritt 1.5.1.1) und waschen Sie die Folien für 45 Sekunden mit VE-Wasser (siehe Abschnitt 1.3). Die Objektträger in die Lösung, die in Schritt 1.5.2.2 und brüten die Folien bei 37 ° C für 30 min in einer feuchten Kammer vor Licht geschützt wurde hergestellt. Trocknen Sie die Dias und dann spülen sie durch Eintauchen in VE-Wasser für 2 min. Gegenfärbung der Zellen durch einige Tropfen Hematoxylin Lösung zugegeben und für 1 min inkubiert. Waschen Sie die Folien mit neutralem Wasser (pH 7) und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Einen Tropfen des Mediums 2 zu den Zellen der Montage mit einer Kante eines Deckglas auf den Objektträger und vorsichtig absenken auf die Zellen mit einer Pinzette. Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um Luftblasen zu entfernen. Alpha-Naphthyl-Butyrat-Esterase (NBE) Aktivitätstest Warm α-naphthyl Butyrat Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch. Verdünnen Sie eine Tablette von Natrium nitin 6,25 ml entionisiertem Wasser rite. In einem 50-ml-Röhrchen, fügen Sie 1,5 ml einer Natriumnitritlösung Tablette und 1,5 ml einer Lösung Pararosanilin. Vorsichtig mischen und lassen Sie die Lösung für 5 min stehen. Supplement, die Lösung mit 40 ml Phosphat-gepufferte Lösung. Bringen Sie auf pH 6 durch vorsichtiges 10 N NaOH tropfenweise hinzugefügt wird. 5 ml der α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, die gesamte Lösung mischen, und übertragen sie in ein Gefäß Coplin. Befestigen Sie die Zellen auf die Objektträger für 10 Sekunden die CAF-Lösung bei RT mit und spülen Sie für 45 Sekunden mit entsalztem Wasser. Objektträger in die Glasküvette mit der Lösung, die in Schritt 1.5.3.2 und Inkubation zusammen für 1 Stunde bei 37 ° C in einer feuchten Kammer während vor Licht geschützt wurde hergestellt. Spülen Sie die Folien für 2 min in neutralem Wasser (pH 7) und an der Luft trocknen lassen. Gegenfärbung der Zellen mit Methylenblau-Lösung durch einige Tropfen auf dem Objektträger hinzufügen und für 4 min inkubiert. Tauchen Sie die Folien in Deioziert Wasser für 2 min und lassen sie an der Luft trocknen. Um die Folien montieren, gelten ein Tropfen des Mediums 2 zu den Zellen Montage, legen Sie eine Kante des Deckglases auf den Objektträger und vorsichtig auf die Zellen senken mit einer Pinzette. Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um Luftblasen zu entfernen. May-Grünwald Giemsa (MGG) Färbung Stain die Zellen (hergestellt in Abschnitt 1.3), indem Sie die Folien in eine Coplin-Gefäß getaucht enthält May-Grünwald-Lösung für 3 min. Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß den pH-Wert 6,8 Pufferlösung für 1 min enthält. Stain die Folien, indem sie in einer Glasküvette Platzierung der Giemsa R-Lösung (verdünnt auf 1/20 in pH 6,8-Pufferlösung) für 10 min enthält. Waschen Sie die Folien mit neutralem Wasser (pH 7) für 10 Sekunden. Abtropfen lassen und Luft trocknen die Folien. Montieren Sie die Folien durch Aufbringen eines Tropfens des Mediums 2 auf die Zellen Montage. Legen Sie eine Kante des Deckglases auf den Objektträger und vorsichtig absenken aufzu den Zellen mit einer Pinzette. Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um Luftblasen zu entfernen. 2. In – vivo – Entwicklung und Charakterisierung von akuter Leukämie HINWEIS: Vier Wochen alte weibliche kongenen C57BL / 6J-Mäuse wurden Ly5.1 unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten ( das heißt in einer sterilen Umgebung). Die Mäuse injiziert wurden, wenn sie zwischen 5 und 6 Wochen alt. Die intravenöse Injektion mit C1498 Zellen Ernten Sie die kultivierten C1498 Zellen in Suspensionen durch Pipettieren. Übertragung der Zellen auf eine 50 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 350 xg für 10 min. Waschen Sie die Zellen in 10 ml kaltem PBS zweimal und Herstellung einer Zellsuspension von 10 7 Zellen / ml in PBS. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis vor der Injektion durchgeführt wird. Platzieren Sie die Maus in einem Verzögerer und führen Sie die Injektion unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube. Verwenden Sie eine 29G Nadel mit einer Spritze, die Zellen in das zu injizierenSchwanzvene. Fassen Sie den Schwanz am distalen Ende, und desinfizieren sie mit einem Gaze-Schwamm in 70% Ethanol getränkt. Überprüfen , um sicher zu sein , daß keine Luftblasen in der Spritze befinden, und dann die Injektion sollte langsam 100 ul der Zellsuspension C1498 (10 6 Zellen) in die Schwanzvene. Nach der Injektion entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz und eine Blutung steuern, indem Druck mit einem sterilen Gazeschwamm an der Injektionsstelle Anwendung. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig und sorgfältig seine Gesundheit in den nächsten Stunden und Tagen überprüfen. Retro orbitale Blutentnahme Überwachen Sie das Verhalten der PBS- und C1498-injizierten Mäuse auf Anzeichen von leukämischen Erkrankungen (zB Piloerektion, Isolierung aus der Gruppe, und keine oder nur geringe Bewegungen im Käfig). HINWEIS: Diese in der Regel zwischen 17 und 19 Tage nach der Anzeige der Zellen injiziert werden. Führen Retro-Orbital Blutentnahme kurz vor Euthanasie (siehe Schritt 2.2.7) unter sterilen Bedingungen in einer laminaren StrömungHaube und unter einer Heizlampe Hypothermie zu verhindern. Für die Anästhesie, Ketamin bei 150 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg verwenden. Bereiten Sie die Anästhesielösung von 1,5 ml Ketamin und 0,5 ml Xylazin in 18 ml PBS-Lösung verdünnt. Anesthetize die Kontrolle und leukämischen Mäusen. Weiter mit einer intraperitonealen Injektion von 200 & mgr; l der anästhetischen Lösung pro 10 g Maus einer 26G Nadel und einer 1 ml Spritze. Überprüfen Sie für den Verlust des Pedals Reflex Anästhesie zu bestätigen. Legen Sie eine Kapillare in den medialen Augenwinkel. Blut wird aus dem orbitalen Sinus in das Kapillarrohr ansteigen. Kontrollieren Sie die Blutung durch sanft Druck auf das Auge mit einem sterilen Gazeschwamm Anwendung. HINWEIS: Ein Volumen von 100 bis 200 & mgr; l Blut kann mit dieser Technik gesammelt werden. Sammeln Sie das Blut in einem EDTA-Röhrchen, und speichern Sie die Probe auf Eis, bevor die mononukleären Zellen zu isolieren. Euthanize die Maus Zervikaldislokation verwenden, undFahren Sie mit den Organen (Abschnitt 2.3) zu isolieren. Organe und Zellen Isolation Organe Isolation Legen Sie die eingeschläfert Maus auf den Rücken auf einer Kunststoffplatte und verwenden Nadeln des Tieres Füße an Pin Organ Isolation zu erleichtern. Desinfizieren Sie die Maus unter Verwendung von 70% igem Ethanol, bevor ein Schnitt durchgeführt wird. Mit einer sterilen Schere, führen Sie einen ventralen Schnitt aus der Bauchhaut an den Hals. Schnitt durch die Bauchdecke in die Leber zu gelangen. Schnitt durch den Brustkorb und die Membran in die Lunge gelangen. Bewegen Sie den Darm zur Seite und entfernen Sie die Milz mit einer sterilen Schere und Pinzette. Um das Knochenmark zu isolieren, schneiden Sie die Beine an der Spitze der Oberschenkelknochen über dem Gelenk mit einer sterilen Schere. Trennen Sie die Tibia vom Femur durch leichtes Ziehen, und entfernen Sie die Haut und Muskeln von den Knochen mit einer Pinzette und Schere. Legen Sie jedes Organ und Knochen in einem 50-ml-Röhrchen mit kaltem PBS, und legen Sie sie auf Eis. Isolierung von Zellen aus den Organen Wiegen Sie die Milz, bevor die Zellen zu stören. Mechanisch stören die Milz, Lunge und Leber, indem sie durch einen 70 & mgr; m Sieb mit einem Spritzenkolben in einem 50-ml-Röhrchen, und sammeln Sie die Zellen in 30 ml kaltem PBS drücken. So sammeln Knochenmarkzellen, legen Sie die Oberschenkel- und Schienbeinknochen in einer Petrischale auf Eis, schneiden Sie die Enden mit einer sterilen Schere, und das Knochenmark spülen durch eine 26G Nadel in einen 10-ml-Spritze befestigt Einsetzen 5 ml kaltem PBS enthält. Disrupt die Knochenmarkszellen durch die Zellsuspension durch die Nadel / Spritze vorbei, und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 um Sieb in einem 50-ml-Tube. Zentrifuge alle Rohre jedes der Organe und die Knochenmarkszellen bei 350 xg für 10 min enthält. Überstand verwerfen und Resuspendieren der gesammelten Zellen aus der Lunge und Knochenmark in 2 ml Lysepuffer (1x) und der Zelles aus der Leber und der Milz in 5 ml Lyse-Puffer (1x) durch vorsichtiges Pipettieren der Mischung nach oben und unten getrennt. Füllen Sie die Rohre auf 50 ml mit kaltem PBS. Zentrifugieren der Zellen bei 350 xg für 10 min. Resuspendieren der Zellen in FACS-Puffer für die Analyse der Durchflusszytometrie oder die Zellen für die Mikroskopie vorzubereiten. Zählen Sie die Zellen, die eine Thoma Zelle Zählkammer mit ihnen nach mit Trypanblau Färbung. Zelloberflächenfärbung von Organen für die Durchflusszytometrie Analyse isolierten Zellen In einer Durchflusszytometrie Rohr Etikett 10 6 Zellen , die aus Organen mit 10 ug / ml gereinigtem anti-CD16 / 32 – Antikörper in 100 & mgr; l FACS – Puffer isoliert. 10 6 Knochenmarkzellen, 100 & mgr; l der folgenden Antikörper oder Kombinationen von Antikörpern und deren entsprechenden Isotypkontrollen verdünnt in FACS – Puffer: anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD115 / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), Anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), Anti-CD11b, anti-CD115 oder anti-CD19 allein für die Entschädigung Einstellungen. Zu Splenozyten, 100 & mgr; l der folgenden Antikörper und ihre entsprechenden Isotypkontrollen in FACS-Puffer verdünnt: eine Kombination von anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1 ) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), Anti-CD11b oder anti-CD19 zur Kompensation Einstellungen. Um Lungen- und Leberzellen, 100 & mgr; l anti-CD45.2 Antikörper und ihre entsprechenden Isotyp-Kontrolle bei 1/100 in FACS-Puffer verdünnt. Inkubieren alle Zell Lösungen für 30 min bei 4 ° C. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen für 5 min bei 350 · g und Verwerfen des Überstandes durch Pipettieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Resuspendieren der markierten Zellen in 500 ul kaltem PBS. Halten Sie die Zellen auf Eis und vor Licht geschützt vor der Durchflusszytometrie für ac Durchführungwerb und Analyse 10. Isolierung von mononukleären Blutzellen und Immunfluoreszenzfärbung für die Durchflusszytometrie-Analyse Bevor das Protokoll starten, vorwärmen die Trennlösung auf RT. Übertragen Sie die Blutprobe (100 bis 200 & mgr; l, erhalten von Schritt 2.2) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen PBS / 1 mM EDTA-Lösung, bis das Lösungsvolumen 500 ul ist. Schicht vorsichtig 500 ul Lösung unter der Lösung trennt das Blut unter Verwendung einer 30G Nadel und eine 1 ml Spritze enthält. Nicht das Blut und die Trennlösung mischen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 800 xg (ohne Bremse) für 20 min bei RT. die zelluläre Ring (die undurchsichtige weiße Schicht) mit einer Pipette Nach dem Zentrifugieren sammeln. Transfer der Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die undurchsichtige weiße Schicht enthält Lymphozyten sowie von Monozyten und erscheint zwischen der unteren Schicht – die Trenn Lösung – und die obere Schicht. 1 mlPBS-Lösung, und Zentrifuge das Rohr bei 350 × g für 10 min. Resuspendieren der Zellen in 600 ul Puffer FACs. Werden 10 & mgr; g / ml gereinigtem anti-CD16 / 32-Antikörper und verteilen 100 ul der Zellsuspension in sechs getrennten Röhrchen (100 & mgr; l jeweils). Beschriften der Zellen mit 100 & mgr; l der folgenden Antikörper oder deren zugehörigen Isotypkontrollen verdünnt in FACS-Puffer: eine Kombination von anti-CD3 (1) / anti-B220 (1) /anti-CD45.2 und anti-Ly6C / anti-CD115 /anti-CD45.2 oder anti-CD45.2 und anti-CD115 allein für die Entschädigung Einstellungen. Inkubieren alle Rohre bei 4 ° C für 30 min. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen, und dann die Röhrchen für 10 min bei 350 xg zentrifugieren und den Überstand verwerfen unter Verwendung einer Pipette. Resuspendieren der markierten Zellen in 500 & mgr; l kaltem PBS. Halten Sie die Zellen auf Eis und vor Licht geschützt vor 10 Durchflusszytometrie Erfassung und Analyse durchführen. Herstellung von Knochenmarkzellsuspensionen auf Objektträger für die Mikroskopie Folgen Sie den in Abschnitt beschriebenen Schritte 1.3, aber in Schritt 1.3.1, verwenden 10 5 Knochenmarkszellen, und in Schritt 1.3.4, drehen Sie die Zellen in jede Kammer bei 72,26 · g für 10 min. Esterase-Aktivitätstests Knochenmarkzellen unter Verwendung von Um die Knochenmark-Esterase Zytochemie Assays durchzuführen, gehen aus den Schritten 1.5 bis 1.5.3.7. May-Grünwald-Giemsa-Färbung von Zellen des Knochenmarks Um Knochenmarkzellen Fleck, folgen Sie dem Protokoll in Abschnitt 1.6, aber in Schritt 1.6.1, brüten die Folien in May-Grünwald-Lösung für 5 min.
Representative Results
Um die C1498-Mausmodell charakterisieren, gingen wir mit zwei großen Schritten. Zuerst wurden die C1498 – Zellen charakterisiert ihre hämatopoetischen Abstammungslinie und Reifungsstufe in vitro (1) zu bestimmen. Diese Zellen wurden dann in kongenen Mäusen injiziert, und die Art der leukämischen Krankheit induziert wurde beurteilt unterschiedliche Merkmale bestimmen: leukämischen Zellinfiltration, ihren Phänotyp, eine Quantifizierung der hämatopoetischen Zellen (mature und Progenitoren / Precursoren) in Knochenmark, die Frequenzen von C1498-Zellen und reifen hämatopoetischen Zellen im Blut und einer Beurteilung der Organschwellung (in der Milz, Leber und Lunge) und zelluläre Zusammensetzung. Um die C1498 Zellphänotypen in vitro zu charakterisieren, wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Molekülen markiert, die von hämatopoetischen Vorläufern und reifen Zellen (Tabelle 1) ausgedrückt werden, und die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Strömungs cytomet analysiertry. Die C1498-Zellen waren positiv für Zelloberflächenexpression von Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), und sie zeigten eine intrazelluläre Expression von CD3 & egr;, T-Zell-Rezeptor (TCR) Vß Ketten und Mac -3 (2A und B). Die Zellen waren negativ für die Zelloberflächenmarker Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 und pan-NK-Moleküle und für die intrazelluläre Expression von CD4 und CD8 (Daten nicht gezeigt) . Sie wurden dann für Marker von hämatopoetischen Stammzellen und Progenitoren (Tabelle 1) untersucht. Sie waren auch negativ für Zelloberflächenexpression von CD117, CD34, Sca-1, CD150 und CD16 / 32 (Daten nicht gezeigt). Diese leukämischen Zellen wurden dann getestet, um die Expression von Adhäsionsmolekülen, die Antigenpräsentation und co-stimulatorische Moleküle zu bestimmen. Die Zellen exprimierten die Oberflächenmarker LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), H-2D b und waren negativ für MHC – Klasse II, CD80, CD86 und CD274 (Daten nicht gezeigt). C1498-Zellen therefore ausgedrückt beide myeloischen (Mac-1, Mac-3) und lymphatischen Markern (B220, CD3, TCR). Um besser auf ihre hämatopoetischen Abstammungslinie zu charakterisieren, wurde Myeloperoxidase Expression unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Alle Zellen waren positiv für die Myeloperoxidase, die ihre myeloiden Ursprungs (3A) verifiziert. Eine Mehrheit der Zellen auch positiv gefärbt für α-Naphthyl – Butyrat Esterasen (3B, linke Tafel), und einige von ihnen für die Naphthol – AS-D chloroacetate Esterasen (schwarze Pfeile) (3B, rechts) gefärbt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen, Mischungen von monozytären und granulozytäre Zellen enthalten. Nach dem May-Grünwald Giemsa durchgeführt wurde, wurden die C1498 – Zellen beobachtet eine Explosion förmige Morphologie mit einem hohen Kern-Zellplasma – Verhältnis angezeigt werden , 3 bis 5 Kernkörperchen im Kern, ein perinukleären Halo, zahlreiche Vakuolen und ein basophilen Zytoplasma (3C ). thuns wird die C1498-Zelllinie von Monoblasten und Myeloblasten zusammen. Die C1498 – Zellen (CD45.2 +) wurden dann intravenös in CD45.1 + injizierten Mäusen. Die Mäuse erlag 17 bis 19 Tage, nachdem die Zellen injiziert wurden. Diese Mäuse wurden getötet, so dass ihre Leukämietyp analysiert werden, bevor sie an der Krankheit gestorben. Die Kontrollmäuse, die mit PBS injiziert wurden, wurden in den gleichen Zeitpunkten zum Vergleich analysiert. Der C1498-Zellen injizierten Mäuse zeigten massive Infiltration von C1498 – Zellen in ihrem Knochenmark, wie es durch den Hochartiges Aussehen der Zellen zeigten nach der May-Grünwald – Giemsa – Färbung (4A) durchgeführt wurde. Sie bewahrt ihre monozytären und granulocytic Phänotypen (4B und C), eine Ansammlung von monoblastischen und myeloische Zellen zeigen , die charakteristisch für akute myelomonozytische Leukämie ist. Um determine ob Markzahlen hämatopoetischen Zellen nach leukämischen Zellen Invasion niedriger waren, CD45.2 + C1498 – Zellen, B lymphatischer, monozytären und granulocytic Populationen (einschließlich Vorläufern, Vorläufern und reifen Zellen) wurden unter Verwendung von Immunfluoreszenzanfärbung quantifiziert und multiparametrisches Durchflusscytometrieanalyse. Leukämischen Zellen 16 bis 36% der hämatopoetischen Zellen dargestellt (Daten nicht gezeigt). Die anderen Zelltypen wurden alle in deutlich niedrigeren Zahlen in den C1498-injizierten Mäusen als in den PBS-injizierten Mäusen (von 5-fach im Durchschnitt für B-Zell-Subpopulationen, 4-fach im Durchschnitt granulocytic Zellen und 3-fach im Durchschnitt für monozytären Subsets) (5A bis C). Eine Untersuchung der Frequenzen von mononukleären Zellen in leukämischen und Kontroll – Maus Blutproben zeigten , daß sie einen vergleichbaren Prozentsatz der Lymphozyten (Figur 6A) , aber eine höhere Frequenz monozytären enthaltenenund leukämischen Zellen. Diese Eigenschaften sind repräsentativ für akute myelomonozytische Leukämie 11 (6B). Zu den weiteren Merkmalen der akuten Leukämie myelomonocytic 12, die C1498-injizierten Mäusen mit geschwollenen Leber (Hepatomegalie) präsentiert, Lunge und Milz (Splenomegalie) (7A). Verschiedene Frequenzen von CD45.2 + C1498 – Zellen wurden in diesen Organen mit Immunfluoreszenzanfärbung erkannt und Durchflusszytometrie – Analyse (7B). Wie Splenomegalie aus hohen Zahl von infiltriert Monozyten führen kann, schätzten wir auch die Anteile von Milz- Populationen. Die Zahl der Zellen in der B – lymphozytische, monozytären und granulocytic Zellfraktionen waren signifikant größer ist , um durchschnittlich 2-fach, 2,5-fach und 3-fach bzw. in leukämischen Milzen als bei den Kontroll Milzen (7C). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi thin-page = "1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls Set Up für in – vitro – Charakterisierung von Cultured C1498 Zelllinien und in – vivo – Beschreibungen von akuter Leukämie. Hämatopoetischen Abstammungslinie und dem Differenzierungsstadium von Gewebekultur C1498 – Zellen wurden zuerst bestimmt. C1498-Zellen wurden dann in kongenen Mäusen injiziert, um die Entwicklung von akuter Leukämie zu induzieren. Die Isolierung von Knochenmark, peripherem Blut, Milz, Leber und Lungengewebe wurde durchgeführt, um die Frequenzen, Phänotypen und morphologische Veränderungen nach der C1498-Zellen-Infiltration zu bestimmen. IV: Intravenous MGG. May-Grünwald Giemsa Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. ad / 54270 / 54270fig2.jpg "/> Abbildung 2 Phänotypische Analyse von C1498 – Zellen nach in vitro – Kultur. Representative Durchflusszytometrie Punktplots und Histogramme der Zelloberfläche (A) und intrazelluläre (B) C1498-exprimierten Moleküle , die mit hämatopoetischen mature Zelldifferenzierung zugeordnet wurden , sind gezeigt. C1498-Zellen wurden aus den Kulturen geerntet, gewaschen und markiert fluoreszierenden Antikörpern, die für die Zelloberflächen CD11b, CD18 und B220 Marker oder deren Isotypkontrollen spezifisch waren. Für die intrazelluläre Färbung wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und markierten Antikörpern, gerichtet gegen Mac-3, CD3 & egr; und ein gemeinsames Epitop des TCR (T-Cell Receptor) Vß-Kette oder deren Isotyp-Kontrollen verwendet. Die Analysen wurden unter Verwendung von Gating mit lebenden Zellen durchgeführt werden . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 3. Funktionelle und morphologische Charakterisierung von Cultured C1498 Zellen. C1498 – Zellen aus Kulturen und zentrifugiert auf Objektträger für die Mikroskopie. (A) Die Färbung für Myeloperoxidaseexpression geerntet wurden , wurde unter Verwendung von Immunfluoreszenz durchgeführt. (B) Zytochemische Reaktionen wurden verwendet , um die α-naphthyl Butyrat – Esterase (NBE) und Naphthol AS-D chloroacetate Esterase zu analysieren (CAE) Aktivitäten in C1498-Zellen. Die Zellen wurden für jedes Etikett als positiv betrachtet , wenn braun und rot-lila, große zytoplasmatischen Granula bzw. beobachtet. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) Färbung von C1498 – Zellen. Für jede Färbung Experiment wird die Mikroskopie Objektiwergrößerung angezeigt. Jedes Bild ist repräsentativ für drei getrennte Experimente.large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Knochenmark – Morphologien in PBS- und C1498-injizierten Mäusen. Die Knochenmarkzellen von PBS- und C1498 Zellen injizierten Mäusen und zentrifugiert auf Objektträger für die Mikroskopie isoliert. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) Färbung. (B ) α-naphthyl Butyrat – Esterase (NBE) und (C) Naphthol AS-D – Chloracetat – Esterase (CAE) Funktionen wurden mit Zytochemie ausgewertet. Im Feld A, sind die Band (unreife) oder segmentiert (reifen) Neutrophilen weniger sichtbar im Knochenmark der C1498-injizierten Mäusen als die PBS-injizierten Mäusen. Panel B und C zeigen an, daß eine Ansammlung von monocytischen und granulozytäre Zellen in der leukämischen Knochenmark im Vergleich zu den Zahlen in der Kontrollknochenmark beobachtet war. Allemikroskopische Analysen wurden unter Verwendung eines 100 – facher Vergrößerung Ziel durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5. Quantitative Analyse von Medulläre Populations in PBS- und C1498-injizierten Mäusen. Die Knochenmarkzellen von PBS- und C1498 Zellen injizierten Mäusen isoliert wurden und geschätzt nach Zellzählung durchgeführt wurde. Die Frequenzen der verschiedenen Zellpopulationen wurden nach Immunfärbung und lebenden Zellen Durchflußcytometrie – Analyse gated bestimmt. (A) Die B – Zell – Untergruppen enthalten CD19 + B220 + -Zellen in Stufen von pro-B – Zellen , B – Lymphozyten (B) granulozytäre Zellen in dem reifen CD3 – und CD11b + Ly6G + Abstammungslinien, die Vorläufer enthalten ein. nd unreifen und reifen Granulozyten (C) Die Monozyten – Subsets wurden als CD3 definiert – CD115 + und enthalten Zellen in der Vorläufer zu Monozyten Stufen reifen. n = 7 Mäuse / Gruppe, und die Daten werden als Histogramme dargestellt, die Mittel ± SEM zeigt. ***, P <0,0001 und ** p <0,01, t – Test verglichen PBS- und C1498-injizierten Mäusen ungepaarten Studenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 6. Blut – Analyse von mononukleären Zell – Populationen in PBS- und C1498-injizierten Mäusen. Repräsentative Durchflusscytometrie Punktplots von (A) T und B – Lymphozyten – Prozentsätze, die jeweils definiert wurden als CD3 + und B220 + -Zellen in PBS- und C1498-Zellen injiziert. Mäuse (B) monozytären Zellfrequenzen in C1498 leukämischen und Kontrolle (PBS) Mäuse wurden durch die Analyse von CD115 + Ly6C bestimmt – und CD115 + Ly6C hohe Zellen. Die Analyse wurde durch Gating lebenden Zellen durchgeführt. Zum Vergleich leukämischen und Kontrollmäuse, + CD45.2 C1498 Zellen wurden ausgeschlossen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 7. Schätzung der Splenic Populations in Leukämische und Kontrollmäusen. (A) Repräsentative Photographien von Leber, Lunge und Milz in leukämischen Mäusen Quellung im Vergleich zu Kontrollmäusen. Die Milzen wurden gesammelt und gewogen, und Splenozyten wurden folgende Gewebezerstörung gezählt. (B) Histogramm darstellt leukämische Zelle Frequenzen in diffErent Organe nach Immunfärbung wurde für CD45.2 + Zellen durchgeführt , und die Ergebnisse wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert fließen. (C) Ermittlung der Milz – B, granulozytärer und monozytären Zellzahlen nach Immunfärbung und Durchflusszytometrie – Analyse Gating durchgeführt wurden live CD19 + B220 zu identifizieren + , CD3 – CD11b + Ly6G +, CD3 – CD11b + Ly6C – und CD3 – CD11b + Ly6C hohe Zellen. Die Maßstabsbalken für die Lunge, Milz und Leber zeigen an, 1 cm. .. n = 5 bis 8 Mäuse / Gruppe, und die Daten werden in Histogrammen als Mittelwert ± SEM dargestellt *, p <0,05; **, p = 0,0033, ungepaarten Student-t- Test Vergleich PBS- und C1498-injizierten Mäusen Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <tbody> Zelltyp Membran oder intrazelluläre Moleküle Precursors und reifen Zellen NK-Zellen NK1.1 +, pan-NK + NKT-Zellen NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + T-Lymphozyten TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + B-Zellen-Vorläufer und B-Lymphozyten B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + granulocytic Vorläufer und Granulozyten Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + Monozyten-Vorläufern und Monozyten / Makrophagen CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi Stammeltern multi- Vorläufern CD117 + Sca-1 + CD34 + (Lin- CD150-) lymphatischen grundierten multi- Vorläufern CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-) gemeinsame lymphatischen Vorläufern CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin-) gemeinsame myeloischen Vorläufern CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- Sca-1-) Granulozyten-Makrophagen-Vorläufern CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- Sca-1-) Megakaryozyten-erythroiden Vorläufern CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- Sca-1-) Hämatopoetischen Stammzellen CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34) Tabelle 1 Marker hämatopoetischer Zelllinien und Differenzierung. CD: Cluster der Differenzierung; Lin: Marker von reifen Zellen; lo:niedrige Expression; hallo: hohe Expression; int: Zwischen Ausdruck; NK: natürliche Killerzellen; TCR: T-Zell-Rezeptor.
Discussion
In früheren Studien wurde die C1498 – Zelllinie als Induktor von akuter granulozytärer 5 beschriebenen myelomonocytic 6 oder 7 NKT – Zell – Leukämie. Allerdings demonstrative Daten in der Literatur waren entweder nicht vorhanden oder unvollständig sind. Das Protokoll vorgestellt hier verwendet verschiedene Techniken, wie Durchflusszytometrie, Immunofluoreszenz, MGG-Färbung und cytochemischen Assays kultiviert C1498-Zellen zu charakterisieren und die Art der Leukämie zu bestimmen, die in Mäusen induziert wird, nachdem sie injiziert werden.
Wenn wir in vitro kultiviert C1498 – Zellen nach Immunfärbung phänotypisiert und Zytometrie Analysen Fluss durchgeführt wurden, beobachteten wir einige Einschränkungen , da diese Zellen einige Zelloberfläche hämatopoetischen Marker exprimiert , die 6,7 in der Literatur bereits beschrieben worden sind. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen Labelle et al. Haben die Zelloberflächenexpression von reifen TCR auf C1498 – Zellen unter Verwendung von Fluss cytomet nicht beobachtenry Färbung. Allerdings hielten sie ihnen eine NKT – Zelllinie zu sein , nachdem sie 7 CD3 & egr; und TCRVβ8.2 mRNAs nachgewiesen. Wir beobachteten auch die intrazelluläre Expression von CD3 & egr; TCRVβ Ketten und Moleküle in die meisten Zellen (> 70%), aber ihre hämatopoetischen Abstammungslinien konnte nicht bestimmt werden, weil es auch die gleichzeitige intrazelluläre Expression des Moleküls Mac-3 war.
Myeloperoxidase, MGG-Färbung und Einschätzungen funktionelle Esterasen zu analysieren Zytochemie mit gezeigt, dass die C1498-Zelllinie eine myeloische Ursprung hatte und von Monoblasten und Myeloblasten zusammen. Diese Ergebnisse waren konkordant mit dem Prozentsatz der Mac-3 + Zellen , die in Durchflusszytometrie Färbungsanalyse erhalten wurden. Obwohl nicht quantitative, diese Schritte Schlüsselexperimente darstellen durchgeführt werden. Tatsächlich bleiben sie bisher die besten bestehenden Methoden zur Charakterisierung der Linie und Differenzierungsstadium von hämatopoetischen Zellen, die keine oder f ausdrückenew spezifische phänotypische Marker.
Die Durchflusszytometrie Färbung war hilfreich für die Entwicklung von akuter Leukämie in congenic Mäusen demonstriert nach C1498-Zellen wurden intravenös injiziert. Die CD45.2 + C1498 – Zellen , die in das periphere Blut und verschiedene Organe infiltriert wurden isoliert, und ihre Frequenzen bestimmt. Eine quantitative Bestimmung wurde auch inhärente Mark und Milz-Zellen nach Immunophänotypisierung durchgeführt, um zu analysieren. Einschränkungen aufgetreten sind , wenn die C1498 Zellphänotyps in Organen wurde untersucht , wie sie einige hämatopoetischen Marker exprimiert (nur einige von ihnen waren B220 +). So definieren die Art der beobachteten akuten Leukämie, May-Grünwald-Giemsa-Färbung und eine Analyse der Aktivitäten von monozytären und granulocytic Esterasen wurden unter Verwendung von Knochenmark durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass C1498 Zellen behielten ihre myeloische und monoblastischen Morphologie und Funktion, den Beginn der myelomonocytic Leukämie enthüllt.
<p class = "jove_content"> Als Gegenleistung für die kritischen Schritte in diesem Protokoll beschrieben ist, sollte besonderes Augenmerk auf pH-Wert gegeben werden, wenn cytochemischer Reaktionen und MGG-Färbung durchzuführen, da Fehler in pH-Wert zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen kann. Beispielsweise Esteraseaktivität α-naphthyl Butyrat ist spezifisch für Monozyten-Zellen, die nur bei einem pH von 6,0, da Granulozyten und Lymphozyten auch positiv für diesen Test bei höheren pH-Werten beflecken kann. die Zellen fixiert wird nicht vor der Durchführung MGG-Färbung empfohlen, und wir haben gezeigt, dass nur CAF Fixierung zufriedenstellende Ergebnisse zur Verfügung gestellt, wenn Esterasen cytochemischer Reaktionen unter Verwendung von C1498-Zellen durchführen. Zu erhalten Zytometrie die Expression des CD115 – Moleküls und dessen Detektion durch Strömungs, alle Proben (beispielsweise Blut, Knochenmark und Milzzellen) sollten auf Eis während des Verfahrens gehalten werden. Wenn keine Färbung wird in der Durchflusszytometrie oder / und Immunofluoreszenz Experimente, die Referenz der Antikörper, deren Lagerung re beobachtetLob und ihre Verdünnungen sollten überprüft werden. Die Verweise in den Materialien / Ausrüstung Tabelle angegeben wurden für die Durchflusszytometrie oder Immunofluoreszenz Anwendungen ausgewählt. Die primäre / sekundäre Antikörper oder deren konjugierte Fluorophore könnten ihre Aktivität durch falsche Lagerung verloren haben (zB Einwirkung von Licht oder Wärme), unsachgemäße Verdünnung, umfangreiche Einfrieren / Auftauen oder die Verwendung von kontaminierten Puffer. Führen positive Kontrollen, um sicherzustellen, dass sie ordnungsgemäß funktionieren. Mit der Maus Knochenmark oder Milz-abgeleiteten Zellen, die die Proteine von Interesse sind dafür bekannt, zum Ausdruck bringen. Um eine hohe Hintergrund und nicht-spezifische Färbung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass sich die Zellen richtig gewaschen werden und gehalten bei hoher Luftfeuchtigkeit (für Immunofluoreszenz) und dass die Antikörper verdünnt, wie angewiesen. Verwenden Sie die gleiche Konzentration und Verdünnung für die Isotypkontrollantikörper und dem primären Antikörper, um genau die Hintergrundebene in der Probe zu bestimmen. Für Esterase Zytochemie Experimenten wurde dieReagenzien können mit positiven und negativen Steuerschiebern enthalten , gereinigter Maus splenic granulocytic (Ly6G +) und monozytären (CD115 + Zellen) getestet werden.Das Verfahren in dieser Studie beschrieben , zeigte , dass viele der leukämischen Merkmale in Mäusen nach der Injektion von C1498 – Zellen beobachtet geteilt gemeinsame Merkmale mit der menschlichen akuten myelomonozytäre Leukämie 11,12. Die Invasion leukämischen Zellen führte zu einer Reduktion von reifen und unreifen (Vorläufern und Vorprodukte) Mark hämatopoetischen Zellen. C1498-Zellen vorhanden sind, mit hoher Frequenz (> 20%) in dem peripheren Blut, wie monozytären Zellen sind. Hepatomegalie und Splenomegalie beobachtet von der Infiltration von leukämischen Zellen führen und deutliche Steigerungen in B-Lymphozyten und myeloischen Zellen wurden auch Splenomegalie zu begleiten beobachtet. Thrombopenie wurde auch beobachtet, wenn Blutplättchen Zahlen geschätzt wurden ein Hämatologie-Analysator.
Es war Shown, で – vitro – Experimenten mit, dass C1498 Zellen hemmen normalen murinen Hämatopoese durch lösliche Faktoren 13 sezer. In mehreren Tumormausmodellen, unreifen myeloischen Zellen (einschließlich Monozyten – und granulozytäre Zellen) haben auch gezeigt, aus dem Knochenmark in die Milz zu wandern, wo sie 14 anti-Tumor – spezifische T – Zell – Aktivierung und Proliferation hemmen. So haben die Reduktion in hämatopoetischen Zellen, die im Knochenmark beobachtet wurde, könnte entweder von einem Mangel in der Hämatopoese und / oder von ihrer Auswanderung geführt. Dieser letztere Mechanismus könnte die Anwesenheit von Monozytose im peripheren Blut oder die Beobachtung der vergrößerten myeloische Fraktionen in der Milz erklären. Es ist auch denkbar, dass diese Zellen von einem verbesserten splenic Hämatopoese abgeleitet worden sein könnte. Tatsächlich unter stationären Bedingungen wurden einige Untergruppen von Milz – B – Zellen , die als Vorläufer der reifen B – Lymphozyten 15. Außerdem unter entzündlichen Erkrankungen, medullary Stamm- und Vorläuferzellen wurden in die Milz zu verlagern 16 gezeigt , die Produktion von reifen Monozyten zu induzieren. Dieses Protokoll erlaubt uns nicht, Rückschlüsse auf die Mechanismen zu zeichnen, die bei der Entwicklung von Leukämie und zusätzliche funktionelle sowie molekulare Tests beteiligt sind, so zu tun, eingesetzt werden. Allerdings umfassen diese Daten detaillierte Informationen über die klinischen Merkmale der akuten myelomonocytic Leukämie und hilft Forschern dabei, die Auswirkungen neuer Therapeutika zu bewerten und zu verstehen.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
Materials
| C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
| C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
| Cells culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
| HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
| Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
| Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
| Flow cytometry staining reagents | |||
| anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
| anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
| anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
| anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
| anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
| anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
| anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
| anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
| anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
| anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
| purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
| anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
| anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
| anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
| anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
| anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
| anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
| anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
| anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
| anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
| anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
| anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
| anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
| anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
| anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
| anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
| anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
| anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
| anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
| anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
| anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
| anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
| streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
| Immunofluorescence staining reagents | |||
| Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
| anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
| Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
| Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
| Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Esterase cytochemical staining reagents | |||
| Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
| Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
| pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
| Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
| Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
| Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
| mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
| May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
| May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
| Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
| pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
| Others materials, reagents and equipment | |||
| Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
| Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
| Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
| PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
| Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
| Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
| NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
| 50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
| Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
| Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
| EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
| Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
| 26G needle | Terumo | NN-2613R | |
| insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
| 30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
| Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
| Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
| Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
| Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
| Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
| Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
| Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Ethanol | Merck | 1.08543 | |
| Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |
参考文献
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