Ce manuscrit fournit un procédé technique qui peut être utilisée pour caractériser des cultures de cellules C1498 in vitro et la leucémie aiguë induite chez la souris après leur injection. analyses phénotypiques et fonctionnelles sont effectuées à l'aide de cytométrie de flux, la microscopie d'immunofluorescence, cytochimie et May-Grünwald Giemsa.
L'injection intraveineuse de cellules C1498 à des souris syngéniques ou congéniques a été réalisée depuis 1941. Ces injections se traduisent par le développement de la leucémie aiguë. Cependant, la nature de cette maladie n'a pas été bien documentée dans la littérature. Ici, nous fournissons un protocole technique pour caractériser les cellules C1498 in vitro pour déterminer la nature de la leucémie induite in vivo. La première partie de cette procédure est axée sur la détermination de la lignée hématopoïétique et le stade de la différenciation des cellules C1498 cultivées. Pour ce faire, multiparamétrique coloration par cytométrie de flux est utilisée pour détecter des marqueurs de cellules hématopoïétiques. La microscopie en immunofluorescence, cytochimie et coloration May-Grünwald Giemsa sont ensuite effectuées pour évaluer l'expression de la myéloperoxydase, l'activité des estérases et la morphologie cellulaire, respectivement. La seconde partie de ce protocole est consacrée à la description de la maladie de la leucémie qui est induite dansvivo. Ce dernier peut être réalisé en déterminant les fréquences des cellules leucémiques et inhérentes dans le sang, les organes hématopoïétiques (par exemple, la moelle osseuse et la rate) et les tissus non lymphoïdes (par exemple, le foie et les poumons) en utilisant une coloration spécifique et cytométrie de flux analyses. La nature de la leucémie est alors confirmée à l'aide de May-Grünwald Giemsa et coloration pour esterases spécifiques dans la moelle osseuse. Ici, nous présentons les résultats qui ont été obtenus en utilisant ce protocole chez les souris C1498- et PBS-injecté âge.
la leucémie myéloïde aiguë (LMA) est caractérisée par la prolifération incontrôlée des cellules myéloïdes hématopoïétiques qui sont bloqués à différents stades de maturation. Cette dysrégulation peut affecter le granulocytaire, monocytaire, érythrocytaire ou voies de différenciation megaryocytic 1. les cellules AML accumulent dans la moelle osseuse, ce qui conduit à une altération de l'hématopoïèse, ce qui se traduit par une thrombopénie, une lymphopénie et une anémie. Les cellules leucémiques envahissent également le sang et les organes non lymphoïdes.
Le modèle C1498 de la souris a été utilisé pendant des décennies comme un modèle pour la leucémie aiguë puisque les cellules cancéreuses ont été isolées à partir d' un 10-month-old souris femelle leucémique C57BL / 6 (H-2 b) en 1941. La littérature décrit l'invasion dans le sang , les organes hématopoïétiques (par exemple, les ganglions lymphatiques et la rate) et des organes non-hématopoïétiques (par exemple, le foie, les poumons, les ovaires et les reins) par les cellules C1498 hautement prolifératives après qu'ils ont été injectés via un dansintraveineux, sous – cutanée ou par voie intra-péritonéale à des souris sensibles 2-4. Toutefois, ce modèle de souris a été signalé pour induire soit granulocytaire 2,5 ou myélomonocytaire 6 leucémie. Plus récemment, une étude publiée en 2002 décrit ce type de cancer que NKT murine leucémie 7. Ainsi, la littérature est différente en ce qui concerne la nature de cette lignée de cellules C1498 et la leucémie associée qu'il induit chez la souris. Ces écarts sont principalement dus à un manque d'informations détaillées et publiées à jour sur les cellules et la maladie leucémique en général, parce que de nombreuses études ont été réalisées dans les années 1950 – 70.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour décrire la façon de caractériser les cellules C1498 et analyser la nature de la maladie leucémique qui est induite par l'injection intraveineuse à des souris. La première partie de ce protocole est consacrée à la description des cellules C1498 qui ont été cultivées in vitro. fluorescent anti-organismes dirigés contre la surface et des marqueurs hématopoïétiques intracellulaires ont été utilisés pour déterminer leur phénotype cytométrie en flux. La présence de la myéloperoxydase a été évalué en utilisant la microscopie à immunofluorescence, leur lignée et la différenciation hématopoïétique étape a été évaluée à l'aide cytochimie pour évaluer l'activité des estérases et May-Grunwald Giemsa a été réalisée. Les cellules C1498 ont ensuite été injectées dans des souris, et la maladie de la leucémie aiguë qui a été induit est décrit dans la seconde partie de ce manuscrit. Les mêmes techniques ont été utilisées pour déterminer les fréquences et les phénotypes des cellules leucémiques et inhérentes à la moelle osseuse, le sang périphérique, la rate et les organes non-hématopoïétiques (le foie et les poumons).
Ce protocole est hautement reproductible, et les données présentées ici permettra aux chercheurs d'évaluer les effets de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce modèle de la leucémie de la souris a déjà été utilisé pour tester l'immunothérapie approche d'unnd différents médicaments chimiothérapeutiques du cancer 8,9. Leur efficacité a été évaluée en déterminant l'évolution de la charge tumorale et le taux de survie. Ce protocole peut être utilisé pour fournir des informations supplémentaires sur la distribution et de subsistance des populations de cellules hématopoïétiques leucémiques et d'autres pendant le traitement.
Dans des études antérieures, la lignée cellulaire C1498 a été décrit comme un inducteur de myéloïde aiguë 5, myélomonocytaire 6 ou 7 NKT leucémie. Toutefois, les données démonstratifs dans la littérature étaient absents ou incomplets. Le protocole présenté ici utilise différentes techniques telles que la cytométrie en flux, l'immunofluorescence, des dosages et MGG coloration cytochimique pour caractériser les cellules cultivées et C1498 pour déterminer la nature de la leucémie qui est induite chez la souris après leur injection.
Lorsque nous phénotypé dans les cellules C1498 cultivées in vitro après immunocoloration et de cytométrie de flux analyses ont été effectuées, nous avons observé certaines limites parce que ces cellules expriment quelques marqueurs hématopoïétiques de la surface cellulaire qui ont été décrits dans la littérature 6,7. En accord avec nos résultats, Labelle et al. N'a pas observé l'expression de surface cellulaire mature TCR sur les cellules C1498 utilisant cytomet de fluxry coloration. Cependant, ils les considéraient comme une lignée de cellules NKT après avoir détecté CD3e et TCRVβ8.2 ARNm 7. Nous avons également observé l'expression intracellulaire des chaînes TCRVβ et molécules CD3e dans la plupart des cellules (> 70%), mais leurs lignées hématopoïétiques n'a pu être déterminée, car il y avait aussi l'expression intracellulaire concomitante de la molécule Mac-3.
Myéloperoxydase, la coloration au MGG et des évaluations pour analyser les esterases fonctionnels à l'aide cytochimie démontré que la lignée de cellules C1498 a une origine myéloïde et se composait de monoblastes et les myéloblastes. Ces résultats sont concordants avec le pourcentage de Mac-3 + cellules qui ont été obtenues dans l' analyse de cytométrie en flux de la coloration. Bien que non quantitative, ces étapes représentent des expériences clés à effectuer. En effet, ils restent, jusqu'à présent, les meilleures méthodes actuelles de caractérisation de la phase de cellules hématopoïétiques qui expriment ou non f lignée et la différenciationmarqueurs phénotypiques spécifiques Ew.
Cytométrie de flux coloration a été utile pour démontrer le développement de la leucémie aiguë chez la souris congéniques après C1498 cellules ont été injectées par voie intraveineuse. Les CD45.2 + C1498 cellules qui se sont infiltrés dans le sang périphérique et divers organes ont été isolés, et leurs fréquences ont été déterminées. Quantification a également été réalisée pour analyser médullaires inhérente et les cellules spléniques après immunophénotypage. Limitations ont été rencontrées lorsque le phénotype de cellules C1498 a été examiné dans les organes comme ils ont exprimé quelques marqueurs hématopoïétiques (seulement quelques – uns d'entre eux étaient B220 +). Pour définir la nature de la leucémie aiguë observée, May-Grünwald Giemsa et une analyse des activités des monocytes et estérases granulocytes ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse. Les résultats ont montré que les cellules C1498 ont conservé leur morphologie et la fonction myéloblastique et monoblastiques, révélant l'apparition de la leucémie myélomonocytaire.
<p class = "jove_content"> En contrepartie des étapes critiques décrites dans ce protocole, une attention particulière devrait être accordée à pH lors de l'exécution des réactions cytochimiques et MGG coloration car les erreurs de pH peuvent conduire à des interprétations erronées des résultats. Par exemple, une activité esterase butyrate α-naphtyl est spécifique à des cellules monocytaires seulement à un pH de 6,0, car les granulocytes et les lymphocytes peuvent également colorées positivement pour ce test à des valeurs de pH plus élevées. Fixateur les cellules ne sont pas recommandé avant d'effectuer MGG coloration, et nous a montré que seulement la fixation CAF a fourni des résultats satisfaisants lors de l'exécution des estérases réactions cytochimiques utilisant C1498 cellules. Afin de préserver l'expression de la molécule CD115 et sa détection par cytométrie en flux, tous les échantillons (cellules par exemple, le sang, la moelle osseuse et la rate) devrait être maintenu sur la glace au cours de la procédure. Si aucune coloration est observée dans la cytométrie de flux et / ou des expériences d'immunofluorescence, la référence des anticorps, leur re de stockagefélicitations et leurs dilutions doivent être vérifiées. Les références indiquées dans le tableau des matériaux / équipements ont été sélectionnés pour des applications de cytométrie de flux ou d'immunofluorescence. Les principaux anticorps / secondaires ou leurs fluorophores conjugués pourraient avoir perdu leur activité due au stockage inapproprié (par exemple, l' exposition à la lumière ou à la chaleur), la dilution inappropriée, vaste congélation / décongélation ou l'utilisation de tampons contaminés. Exécuter des contrôles positifs pour veiller à ce qu'ils fonctionnent correctement. Utiliser osseuse de souris des cellules de rate dérivées qui sont connues pour exprimer les protéines d'intérêt ou de la moelle. Pour éviter un bruit de fond et la coloration non spécifique, assurez-vous que les cellules sont lavées correctement et maintenus à une humidité élevée (pour immunofluorescence) et que les anticorps sont dilués selon les instructions. En utilisant la même concentration et la dilution de l'anticorps témoin isotypique et l'anticorps primaire afin de déterminer avec précision le niveau d'arrière-plan dans l'échantillon. Pour les expériences estérase de cytochimie, lales réactifs peuvent être testés à l'aide de lames de contrôle positif et négatif contenant des granulocytes de souris purifié splénique (Ly6G +) et les cellules monocytaires (CD115 +).La procédure décrite dans cette étude a montré que bon nombre des caractéristiques leucémiques observés chez les souris après l'injection de cellules C1498 partagé caractéristiques communes avec la leucémie myélomonocytaire aiguë humaine 11,12. Les cellules leucémiques envahies ont donné lieu à une réduction des matures et immatures (précurseurs) et les progéniteurs des cellules hématopoïétiques médullaires. les cellules C1498 sont présents à haute fréquence (> 20%) dans le sang périphérique, comme les cellules monocytes. Hépatomégalie et une splénomégalie ont été observées suite à l'infiltration de cellules leucémiques et des augmentations significatives dans les lymphocytes B et les cellules myéloïdes ont également été observées pour accompagner splénomégalie. Thrombopénie a également été observée lorsque le nombre de plaquettes de sang ont été estimées en utilisant un analyseur d'hématologie.
Il était shown, à l' aide des expériences in vitro, les cellules C1498 qui inhibent l' hématopoïèse normale de souris en sécrétant des facteurs solubles 13. Dans plusieurs modèles de souris de tumeurs, les cellules myéloïdes immatures (y compris les cellules monocytaires et granulocytaires) ont également montré que la migration de la moelle osseuse vers la rate où ils inhibent l' activation des cellules T spécifiques anti-tumorale et la prolifération 14. Ainsi, la réduction dans les cellules hématopoïétiques qui a été observée dans la moelle osseuse peut être due à une carence soit dans l'hématopoïèse et / ou de leur migration. Ce dernier mécanisme peut expliquer la présence d'une monocytose dans le sang périphérique ou l'observation des fractions myéloïdes agrandies dans la rate. Il est également envisageable que ces cellules pouvaient être dérivées d'une amélioration de l'hématopoïèse splénique. En effet, dans des conditions de régime permanent, certains sous – ensembles de cellules spléniques B ont été identifiés comme des précurseurs de maturité des lymphocytes B 15. En outre, dans des conditions inflammatoires, medcellules souches et progéniteurs ullary ont été montrés à déménager dans la rate pour induire la production de monocytes matures 16. Ce protocole ne nous permet pas de tirer des conclusions concernant les mécanismes qui sont impliqués dans le développement de la leucémie, et des tests fonctionnels ainsi que moléculaires supplémentaires devraient être employées pour le faire. Cependant, ces données comprennent des informations détaillées sur les caractéristiques cliniques de la leucémie myélomonocytaire aiguë et aideront les chercheurs à évaluer et à comprendre les effets de nouveaux agents thérapeutiques.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
Cells culture reagents | |||
2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
Flow cytometry staining reagents | |||
anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
Immunofluorescence staining reagents | |||
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
Esterase cytochemical staining reagents | |||
Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
Others materials, reagents and equipment | |||
Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
26G needle | Terumo | NN-2613R | |
insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
Ethanol | Merck | 1.08543 | |
Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |