详细的定性C1498小鼠细胞系及其关联白血病小鼠模型协议

动物住房和所有的实验过程由当地动物保护伦理委员会批准，CEEA.NPDC（协议no.512012），并根据实验动物的护理和使用的法国和欧洲的准则进行所有的实验。 1. 在 C1498细胞系的体外表征 在 C1498细胞的体外培养制备完全RPMI（罗斯韦尔园区纪念研究所）加入50毫升胎牛血清（FBS），5 ml青霉素1640培养基（100单位/毫升）-streptomycin（100微克/毫升）中，加入500μl的50mMβ巯基乙醇的，5毫升N-2-羟乙基-N-2-乙烷磺酸（HEPES），5毫升的非必需氨基酸和5毫升丙酮酸钠至500ml RPMI培养基。 成长C1498细胞系完全RPMI。收获在悬浮液中的细胞，通过移液，将细胞转移到50毫升管中。离心机350 XG 10分钟，然后取出superna重要的。 在350 XG加入20毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1×）溶液，离心10分钟，并除去上清液。 悬浮细胞在10ml荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（2.5克牛血清白蛋白（BSA）的粉末和2毫升在500毫升PBS溶液的0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）。计数使用托马细胞与台盼蓝染色细胞计数后室中的细胞。 在C1498细胞的表型鉴定采用免疫组化和流式细胞仪分析细胞表面染色准备流式细胞仪缓冲。 调整在FACS缓冲液中收获的细胞以10 7个细胞/ ml和分配10 6个细胞（在100μl）对每个染色实验入流式细胞管中。 标记用100μlFACS缓冲液稀释下列抗体或它们的相关同种型对照的细胞： 对于M前体细胞和分化细胞的arkers，标号与抗CD11b /抗CD18（1），抗-LY-6G（1），抗CD19，抗B220（2），抗NK1.1，抗细胞CD49b，抗CD4（1），抗CD8（2），抗CD3（3），抗CD21 / 35，抗CD115，抗TCRVβ抗体。 造血干/祖细胞标记物，使用抗CD34的结合/抗CD117 /抗的Sca-1，抗CD150 /抗CD117 /抗的Sca-1，抗CD117 /抗CD127或抗独自CD16 / 32 – 生物素的抗体。 对的细胞功能（ 例如 ，粘附，抗原呈递，共刺激分子和受体）标记物，细胞染色用抗CD18（2）/抗CD11a，抗MHC I类，抗MHC II类，抗CD31，抗CD44，抗CD80-生物素，抗CD86和抗CD274抗体。 孵育所有流式细胞管中流动的，在4℃下30分钟。 洗细胞通过加入2ml FACS缓冲液中向每个管中，离心分离，在350×g离心5分钟，两次，并去除上清。 </LI> 加入100微升的FAC缓冲液中，以每管并通过（在FACS缓冲液1/100 1/200最终稀释度）加入100微升荧光链霉亲到生物素化的缀合的抗体进行二次染色。孵育管在4℃下30分钟。 洗细胞两次如下：在350 xg离心加2ml FACS缓冲液中向每个管中，离心管5分钟，并通过移液除去上清液。 重悬500微升冷PBS的细胞置于冰上的细胞，用铝箔覆盖管保持他们在黑暗中。分析使用流式细胞仪10个结果。 细胞内染色通过加入125毫升4％多聚甲醛（PFA）溶液至375毫升PBS溶液制备的固定缓冲液中。 注意：要在通风橱制成500毫升之4％PFA的，热400毫升PBS溶液至约60℃的搅拌板上。添加20克PFA粉末，并提高pH值直到PFA溶解。允许溶液冷却，调节pH至6.9，并补足体积至500毫升PBS中。 通过加入0.5克皂苷和0.5g的BSA至500ml的PBS溶液制备透缓冲器。 调整在FACS缓冲液中收获的细胞以10 7个细胞/ ml和分发10 6个细胞（100微升）为每个染色实验入流式细胞管中。离心细胞在350 XG 5分钟，去除上清。 固定细胞在200μl的1％PFA溶液中并在4℃孵育10分钟。 在350 XG2毫升透缓冲液添加至每个管，离心管5分钟，并通过移液除去上清液。添加100μl的透化缓冲液至每个管。 标记用100μl下列抗体或它们相应的同种型对照的细胞透化缓冲液稀释它们后：抗CD3（2）/抗CD8（1），抗CD3（3）/一NTI-CD4（2），抗CD107b和抗CD3（3）/抗TCRVβ。 孵育细胞在4℃下进行30分钟。 通过加入2ml透化缓冲到每个管的两次洗细胞。离心管350 XG 5分钟，去除上清。 添加100μl的透缓冲器向细胞。通过加入100微升荧光链霉在透化缓冲液至生物素标记的抗体稀释进行到二次染色。孵育管在4℃下30分钟。 加2ml透化缓冲各管，在350 XG 5分钟离心管，去除上清。重复此步骤一次。 重悬500微升冷PBS的细胞，然后将细胞在黑暗中的冰。分析用流式细胞仪10的流程的结果。 细胞悬浮液在载玻片上为显微镜制备医管局洗10 6rvested C1498细胞（在步骤1.1.4获得）用5毫升冷的FAC缓冲液两次，稀释细胞在1ml冷的FACS缓冲液中。放置管在冰上。 将滑入一次性室预过滤器附加卡和将这些成cytocentrifuge。 加入100微升的FAC缓冲液中向每个腔室和过滤卡，并在4.52×g下旋转他们2分钟。 加入100微升细胞对各室和过滤卡，和自旋细胞在4.52 xg离心2分钟。 小心地从腔室取出幻灯片和髓过氧化物酶（步骤1.4），酯酶（步骤1.5）或月-Grünwald的吉姆萨（步骤1.6）染色之前风干的幻灯片。 髓过氧化物酶染色免疫通过在冷的甲醇中浸渍载玻片固定在载玻片细胞：丙酮（1：1）溶液，2分钟，然后空气干燥的幻灯片。 到液体限制到含有细胞的滑动的面积，画一个词rcle周围使用防水笔细胞。 冲洗在200μl冷PBS溶液的细胞10分钟。 阻断细胞在200μl含有正常驴血清的10微升和10微克/毫升的纯化的抗CD16 / 32的抗体的3％BSA / PBS缓冲液中。 应用200微升抗小鼠髓过氧化物酶（在3％BSA / PBS缓冲液稀释至20微克/毫升）的。孵育细胞O / N，在4℃的湿度室中。 清洗细胞用200μl冷的0.1％BSA / PBS中。 应用200微升在3％BSA / PBS缓冲液1/250稀释的抗山羊IgG抗体。孵育所述细胞在室温下在潮湿箱2小时。 清洗细胞3次，用200μl0.1％BSA / PBS缓冲液中并两次冷PBS。 用200μl的Hoechst的（在1微克/毫升的最终浓度）在室温2分钟在PBS中的1/1000稀释染色细胞核。 用清水洗净，幻灯片和让他们mountin前风干G。应用安装介质1的小区中的一个下降，放置一个盖玻璃的一个边缘到幻灯片，并小心地将其放下到使用镊子将细胞。轻轻按压外盖玻璃，以消除任何气泡。 酯酶细胞化学注：预暖的所有试剂室温。 固色剂的制备制备柠檬酸盐丙酮 – 甲醛（CAF）溶液中，添加2.5毫升柠檬酸盐溶液，6.5毫升丙酮和0.8ml 37％的甲醛至玻璃瓶中。轻轻混匀并在4℃下保存。 色酚AS-D氯乙酸酯酶（CAE）活性测定温的去离子水至37℃。 在50ml管中，加入1毫升亚硝酸钠溶液到1ml的染料溶液。轻轻混匀，静置2分钟。加40毫升预热的去离子水，5毫升的pH 6.3缓冲液浓缩物和1的萘酚AS-D氯乙酸溶液。混合并转移到一个罐子科普林。 固定细胞到幻灯片（见1.3节），用于与CAF溶液（见步骤1.5.1.1）30秒，并洗玻片45秒，用去离子水。 转移滑入这是在步骤1.5.2.2中制备的溶液，并在37°C孵育载玻片在避光湿度室30分钟。 干燥载玻片，然后通过浸入冲洗他们在去离子水中2分钟。 通过加入苏木溶液几滴孵育他们1分钟染液细胞。 与中性水（pH 7）洗涤载玻片并允许风干。应用安装介质2向小区中的一个下降，放置一个盖玻璃的一个边缘到滑动并小心地将其放下到使用镊子将细胞。轻轻按压外盖玻璃，以消除任何气泡。 阿尔法萘丁酯酶（NBE）活性测定使用前暖α萘丁解到37℃。 NIT稀释钠一片RITE 6.25毫升去离子水。 在50ml管中，加入为1.5ml亚硝酸钠片剂溶液和1.5毫升副玫瑰苯胺溶液。轻轻混合，并允许溶液静置5分钟。补充用40ml磷酸盐缓冲溶液中的溶液。通过仔细加入10 N滴加氢氧化钠带给pH值为6。加入5毫升α萘丁解决方案，混合整个解决方案，并将其转移到一个罐子科普林。 用在RT下CAF溶液固定细胞在载片上，持续10秒，冲洗45秒，用去离子水。 转印滑入包含在步骤1.5.3.2制备并一起1小时，在37℃的湿度室中孵育，同时避光溶液中的科普林缸。 冲洗的幻灯片在中性水中2分钟（pH值为7）和空气干燥。 染液与亚甲基蓝溶液中的细胞在幻灯片上加入几滴孵育4分钟。 浸入deio幻灯片的发布水2分钟并允许风干。挂载幻灯片，应用安装介质2向小区中的一个下降，放置在盖玻璃的一个边缘到幻灯片，并小心地将其放下到使用镊子将细胞。轻轻按压外盖玻璃，以消除任何气泡。 五月 – 格伦沃尔德姬姆萨（MGG）染色通过幻灯片浸入含五月 – 格伦沃尔德溶液中3分钟的科普林氏缸染色细胞（以1.3节准备）。 转移的幻灯片到含有1分钟的pH 6.8的缓冲溶液中的科普林缸。 将它们放置在含有10分钟的吉姆萨R染料溶液（在pH 6.8的缓冲液稀释到1/20）一个科普林缸染色的幻灯片。洗与中性水（pH 7）的幻灯片，持续10秒。 漏和风干的幻灯片。通过施加固定介质2到细胞上的一滴装入滑动。将盖板玻璃的一个边缘到幻灯片，并小心地放下它到细胞中使用镊子。轻轻按压外盖玻璃，以消除任何气泡。 2. 在体内发育和急性白血病的表征注：4周大的雌性同类系的C57BL / 6J-Ly5.1小鼠无特定病原体的条件下维持（ 即，在无菌环境中）。当他们周5和6岁之间的小鼠注射。 静脉注射C1498细胞吹打收获悬浮培养细胞C1498。转移细胞到一个50毫升管中并离心，在350×g离心10分钟。清洗细胞在10ml冷PBS两次，并准备在PBS中的10 7个细胞/ ml的细胞悬浮液。广场上冰的细胞悬浮液进行注射前。 鼠标放置在一个限制器和一个层流罩进行无菌条件下注入。 使用29G针，用注射器注入细胞进入尾静脉。把握tail在远端，并用70％的乙醇中浸泡过的纱布海绵消毒它。检查，以确保有在注射器没有气泡，然后缓缓注入100微升C1498细胞悬浮液（10 6个细胞）至尾静脉。 注射后，从尾部取出针，并通过施加压力以在注射部位中的无菌纱布海绵控制任何出血。返回动物笼子里，并仔细检查其健康在接下来的几个小时和几天。 眼眶采血监视PBS-和C1498-注射的小鼠的为白血病病（ 例如 ，立毛，从组隔离，并减少或在笼不运动）的迹象的行为。 注意：这通常发生17至19天之间的细胞注射后。 只是安乐死之前执行眼眶采血（见步骤2.2.7）在无菌条件下在层流引擎盖下加热灯，以防止体温过低。 麻醉，用氯胺酮150 mg / kg和赛拉嗪在10毫克/公斤。通过稀释1.5毫升氯胺酮和0.5ml甲苯噻嗪的18毫升PBS溶液制备麻醉剂溶液。 麻醉控制和白血病的小鼠。用200微升每10g使用26G针小鼠的麻醉剂溶液的腹膜内注射和1ml注射器进行。检查踏板反射消失，确认麻醉。 插入毛细管进入眼睛的内眦。血液将上升从眼窝窦入毛细管。通过轻轻地用无菌纱布海绵施加压力到眼睛控制出血。 注：100〜200微升血液的体积可以使用这种技术来收集。 收集血液到EDTA管中，并分离单核细胞前在冰上样品存储。 使用颈椎脱位安乐死鼠标和进行隔离器官（第2.3节）。 器官和细胞分离机关隔离放置安乐死鼠标到其上的塑料板回用针引脚动物的脚，以促进器官隔离。消毒用70％的乙醇进行的切口之前鼠标。 使用无菌剪刀，从腹部皮肤到颈部执行腹侧切开。切断通过腹壁来访问肝脏。通过胸廓和访问肺部隔膜切。移动至肠的侧面和除去使用无菌剪刀和镊子脾脏。 以分离骨髓，切腿在使用无菌剪刀接头上方的股骨的顶部。通过轻轻拉动断开股骨胫骨，然后取出使用镊子和剪刀骨头的皮肤和肌肉。 放置在含有冷PBS 50ml管各器官和骨骼，并将它们放置在冰上。 从器官细胞的分离破坏细胞前称量脾脏。通过在一个50ml管中使用的针筒柱塞按压它们通过一个70微米的过滤器机械地扰乱脾，肺和肝脏，并收集细胞为30个毫升冷PBS中。 收集的骨髓细胞，将股骨和胫骨在培养皿中在冰上，使用无菌剪刀剪四肢，并通过插入附连到含有5毫升冷的PBS 10ml的注射器26G针冲出骨髓。 通过将细胞悬浮液通过针/注射器破坏骨髓细胞，并通过一个70微米的过滤器，在50毫升管过滤细胞悬浮液。 离心机所有含每种器官和骨髓细胞在350×g离心10分钟的管子。弃去上清液，并重新悬浮在2毫升的裂解缓冲液（1x）和细胞从肺和骨髓收集细胞轻轻上下吹打该混合物从肝脏和脾脏s隔离在5ml裂解缓冲液（1×）的。管填充50毫升冷PBS。 离心细胞，在350×g离心10分钟。重悬在FACS缓冲液将细胞进行流式细胞术分析或制备细胞显微术。算使用托马细胞计数室中的细胞用台盼蓝染色它们之后。 从机关分离出来流式细胞仪分析细胞的细胞表面染色在流式细胞术管的流动，标签从器官中分离用10μg/ ml，在100微升的FAC缓冲液中纯化的抗CD16 / 32抗体的有10 6个细胞。 至10 6个骨髓细胞，添加在FACS缓冲液稀释抗体的下列抗体或组合以及它们相应的同种型对照的100微升：抗CD11b /抗CD3（1）/抗的Ly6C /抗Ly6G（2），抗B220（1）/anti-CD45.2/anti-CD19，抗CD115 /抗CD3（1）/一个TI-的Ly6C /抗Ly6G（2），抗CD45.2，抗Ly6G（2），抗CD11b，抗CD115或单独为补偿设定抗CD19。 到的脾细胞中，添加以下抗体的100μl的和其相应的同种型对照在FACS缓冲液稀释：（1抗CD11b /抗CD3（1）/抗的Ly6C /抗Ly6G（2），抗B220的组合）/anti-CD45.2/anti-CD19，抗CD45.2，抗Ly6G（2），抗CD11b或抗CD19补偿设置。 肺和肝细胞，添加抗CD45.2抗体的100微升，并在FACS缓冲液1/100稀释其相应的同型对照。 孵育所有30分钟的细胞溶液在4℃下。 通过加入2ml FACS缓冲液中向每个管洗涤细胞。离心管在350 xg离心5分钟，并通过移液弃去上清。重复此步骤一次。 重悬标记细胞在500微升冷PBS。置于冰上的电池和交流电进行术前流避光quisition和分析10。 外周血单个核细胞和免疫荧光染色的隔离流式细胞分析启动协议之前，预温分离溶液至室温。 转移血样（100至200微升来自步骤2.2获得）到微量离心管中，并加入PBS / 1mM EDTA的溶液，直至溶液体积为500微升。仔细层500微升含有使用30G针和1ml注射器血液中的溶液下分离溶液。不要混合血液和分离解决方案。 在800 XG（无制动器），在室温20 min离心管。离心后，收集用吸管蜂窝环（不透明的白色层）。转移细胞到一个离心管中。 注：不透明白色层含有淋巴细胞以及单核细胞和下层之间出现 – 分离溶液 – 和上层。 加入1ml的PBS溶液，并离心管中，在350×g离心10分钟。悬浮细胞在600微升FACS缓冲液中。 添加10μg/ ml的纯化的抗CD16 / 32的抗体与100微升的细胞悬液分配到六个独立的管（每100微升）。 标记的细胞用100μlFACS缓冲液稀释下列抗体或它们的相关同种型对照的：抗CD3（1）/抗B220（1）/anti-CD45.2和抗的Ly6C /抗CD115的结合/anti-CD45.2或抗CD45.2，独自补偿设置抗CD115。 孵育所有试管在4℃下30分钟。 通过加入2ml FACS缓冲液中向每个管洗涤细胞，然后在350 xg离心离心管10分钟，并使用移液管弃上清。 重悬标记细胞在500微升冷PBS。置于冰上的细胞和流式细胞仪采集和分析10执行流之前，避光。 骨髓细胞悬液在玻片上显微镜准备按照1.3节所述的步骤，但在步骤1.3.1，使用10 5骨髓细胞，在步骤1.3.4，旋细胞到每个室在72.26 XG 10分钟。 利用骨髓细胞酯酶活性测定要进行骨髓细胞化学酯酶试验，从出发步骤1.5至1.5.3.7。 骨髓细胞的五月-Grünwald的吉姆萨染色染色骨髓细胞，按照1.6节所述的协议，但在步骤1.6.1，孵化在5 – 格伦瓦尔德解决方案的幻灯片5分钟。