고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석
概要
Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
Abstract
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Introduction
혈관 신생은 편광 방향 특이 마이그레이션 및 혈액 공급을 필요로 조직에 새로운 혈관을 형성하는 내피 세포되는 EC () 촉진 세포 외 신호 단서에 의해 트리거됩니다. 혈관 생성을 유도하는 것으로 생각 요인은 세포 외 기질 (ECM)로부터의 신호이다. 물리적 단서에 대한 응답으로되는 EC는 혈관 네트워크 1, 2의 형성 방향 이동을 안내하는 방향 특이성과 새로운 지점을 확장합니다. EC의 형태와 분기의 아키텍처는 공작 – 마이 오신 수축력 (3)의 규정을 조정하는 방식으로 미세 소관 (MT) 세포 골격의 현지화 규정에 의해 정의된다. 형성하기 위해 EC 분기 위해서는, 마이 오신-II는 로컬 현지화 막 돌기 (4)의 결과로 하향 조절해야합니다. 동시에 셀 내의 동일한 위치에, MT 성장 역학 분기 엘론 홍보 느리고 지속적인 MT 성장 결과 수정 될gation과 안정성 오. 이 조정 골격 규제되는 EC는 방향 마이그레이션을 용이하게하기 위해 자신의 형태를 극화 할 수 있습니다.
편광 세포 형태의 개발은 편광 MT 어셈블리 (6)가 필요합니다. 상피 세포 마이그레이션에서, 이동 단말은 셀 7-9의 최첨단 천천히 그리고 지속적으로 특히 성장; 신경 세포에있는 동안, 축삭 또는 수상 돌기의 시작과 신장은 이동 단말뿐만 아니라 존재해야하지만 그들은 동적으로 조립 및 분해 10 ~ 15의 과정을 겪고있다. 이와 같이, MT 성장 역학 국부 제어는 셀의 구조를 결정하고, EC를 ECM들이 탐색으로 세포 형태의 신속한 개장을 허용한다.
MT 성장 동역학 분자 모터 단백질 및 비 모터 단백질 패밀리에 의해 조절되고, 미세 소관 연관 단백질 또는 미세 소관 상호 작용 단백질 (이하, REFE 지칭) MAP에로 rred. 지도는 로컬 일반적으로 세포 ECM 인터페이스 (16, 17)에서 시작 폭포 신호를 활성화 또는 비활성화 할 수 있습니다. 이동 단말에 결합 및 MT 조립 및 분해의 반응 속도를 변경하여 일단 활성,지도 기능; 따라서 로컬 셀 모양과 극성 18-20을 촉진하기 위해 MT 역학을 조절하는 기능. 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK)는 MT 끝나고 커플 MT 분해 21-23로 ATP 가수 분해에 결합하는 키네신-13 가족 MAP입니다. MCAK의 기능적 역할이 방추사 24-28 내의 중요한뿐만 아니라 계면 29,30 동안 알려져있다. 계면되는 EC 내에서 MCAK 매개 MT의 분해는 상처 가장자리하는 RAC1 작은는 GTPase의 유도 활성화를 응답 MCAK 지역화 오로라-A에 의한 인산화에 의해 조절된다. 이 신호 전달 캐스케이드의 결과 르 향하여 편광 MT 성장 초래되는 EC의 선단에 MCAK의 억제이다되는 EC (31)를 마이그레이션의 후행 가장자리에 가장자리와 MCAK 유도 MT 분해를 ading.
MT 성장 역학을 측정하는 전통적인 방법은 일반적으로 형광 표지 튜 불린이나, 최근에는 형광 표지 MT 최종 바인딩 단백질 1 또는 3 (각각 EB1 또는 EB3) 중 하나의 손 추적을 사용했다. 형광 튜 불린 방식은 전체 MT 어레이 라벨의 이점을 갖는다. 유사 분열 세포 유형의 대부분은 계면 8,32,33 동안 이동 단말의 방사 방향 어레이를 유지하기 때문에, 중심체 주변의 MTS는 매우 조밀하고, 그 결과, 형광 튜 불린으로 MT 성장 분해 추적 보통 주변에 한정 셀 영역. 이러한 제한으로 인해, 형광 표지 EB 단백질 (EB1 또는 EB3)의 활용 MT 역학을 측정하는 일반적인 방법이었다. 사채는 이동 단말의 증가 플러스 엔드 레이블 있기 때문에 밝은 형광 올 (1-3 μm의) 작은 표시TS, 따라서 매우 제한된 배경 형광 34-37로 MT 중합 쉽게 식별 할 마커를 제공한다. 이동 단말 어레이의 일부만 사채 라벨은 EB 접근법의 중요한 강도를 나타낸다는 사실은, 또한 하나의 중요한 한계가 강조되지만, 그 이외의 성장 이동 단말은 EB3 방식으로 분류되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 측정하고 시간이 지남에 EB3 혜성을 추적하고 하위 세포 영역 내에서 MT 성장을 시각화 할 수있는 능력은 MT 조직의 지역 평가를 필요로하는 응용 프로그램이 접근 방식에 이상적이다.
측정 MT 성장 역학에 대한 전통적인 방법의 다른 주요 한계는 매우 큰 데이터 세트 및 데이터 분석에 필요한 시간이었다. 이 제한은 높은 시간 해상도에서 EB 혜성 수백의 손 추적을위한 필요성에서 유래한다. 또한, 이들 측정은 세포의 유의 한 숫자를 이루어도 제어 experime 다양한 하에서 수행 될 필요ntal 조건. 최근, 이러한 제약은 살아있는 세포 35 시간 경과 현미경을 사용하여 구체적으로 추적 EB3 혜성에 관한 전산 분석 기법을 통해 극복하고있다. 적절하게 사용되는 경우, 이러한 계산 방법은 모두 중합 MT를 측정하는 높은 처리량 방법에 대해 제공 할뿐만 아니라 손 추적과 관련된 실수의 가능성을 제한하는 역할을한다. matlab에 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 MT 역학의 전산 분석, plusTipTracker는 형광 표지 EB3 혜성 5,31,35,38을 추적하여 MT 성장을 측정 할 수 있습니다. 또한, plusTipTracker 소프트웨어는 성장 MT 트랙 내에서 EB3 혜성의 실종에 따라 MT 재앙 이벤트 (일명 분해)의 계산을 가능하게하고, 관심의 사용자 정의 영역 내에서 MT 성장 역학의 서브 세포 (일명 지역) 분석이 가능 . 우리의 연구의 경우, MT 성장 역학 내에서 비교 하였다비 분지 영역 대 또는 셀 에지 후행 대 선도 내의 지형 영역. plusTipTracker 소프트웨어로부터의 데이터 출력은 각각의 셀과 하위 셀 영역에 대한 컬러 코드 트랙 오버레이를 생성하는데 사용될 수있다.
여기에서 우리는 MT 성장 역학과 형태 및 방향 이동을 분기 EC의 규정이 MT의 depolymerase의 기여를 변조에 MCAK의 역할을 조사하기 위해 사용하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근이 용이하게 배양하고 플라스미드 cDNA를 전기 유도 일시적인 형질 감염에 매우 의무이다 차 인간 세포주, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)를 사용 하였다. 우리는 그 다음 높은 해상도를 사용, 단백질 3 (EB3)와 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK) – 특정 cDNA를 바인딩 MT 끝으로 형질 전환 된 HUVEC의 시간 경과 형광 현미경은 MT 역학에 효과가 HUVECs를 형질 평가하는 구성한다. EB3의 PlusTipTracker 기반 연산 화상 해석라벨이 지정된 MT 플러스 끝 측정하고 MT 성장 역학에 대한 실험 조작의 효과를 비교하기 위해, 시간 경과 이미지에서 MT 성장 속도와 MT 성장 수명을 측정 하였다. 이 방법론은 MT 역학의 연구 및 서브 셀룰러 지역 내에서 MT 역학의 지역화 된 규정은 EC가 분기 및 마이그레이션의 혈관 신생 과정에 기여하는 방법의 식별이 가능합니다. 이러한 기술은 형광으로 표지 생균 및 발현 될 수있는 임의의 MAP의 연구에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형태학 및 마이그레이션 실험에서 HUVECs를 사용.
HUVEC를 내 EB3 표지 MT 성장 역학 라이브 세포 이미징 그들이 다음 ECM 시그널링 큐에 할당 될 수있는 MT 성장 HUVEC 형태의 변화를 측정하고 평가하기 위하여 적절하고 재생 가능한 세포 배양 조건을 필요로한다. HUVECs를 세포 모양과 운동성을 연구를위한 훌륭한 모델을 나타냅니다. 그들은 모두 가용 물리적 신호 큐에 응답하여 극적인 모폴로지를 나타내는, 형광 표지 된 cDNA를 가진 형질 감염에 매우 의무이며, 그들은 적절한 세포 배양 조건 65-70를 제공 할 때 혈관 튜브로 자신을 구성 할 수있는 능력을 유지한다. HUVEC를 예로서 일차 세포 배양은 세포가 건강 보장하기 위해 그들이 실험 동안 정상적으로 동작 할 것으로 취급에주의 세포 통로 번호 모니터링을 필요로한다. 예를 들어,시 cytoskele 조사 실험을 실시HUVEC를 전형적으로 다섯 통로 열두 주위 불균일 모폴로지를 표시하기 시작 톤 및 / 또는 세포 형태가 된 HUVEC는 열째 세포 배양 통로 이후 실험에 사용되어서는 안된다.
세포 밀도는 HUVEC의 건강과 확산의 중요한 레귤레이터이다. HUVEC 분기 조사 (상기 프로토콜을 10.1-10.4 참조) 세포 그들의 ECM과 상호 작용하는 물리적 공간을 제공하는 분 지형 돌출부를 확장하기 위해 상대적으로 낮은 밀도 세포 배양 물을 사용한다. 대조적으로, 상처 가장자리 이전 연구에서 HUVEC를 전에 상처에 단층 배양이다 (프로토콜 10.5-10.8 참조). 예컨대, 상처 가장자리 HUVEC를 비교적 비 – 분지 형태를 표시하는 바와 같이, 모서리 돌기 선도 연장, 그들은 상처에 마이그레이션 그들의 바로 이웃 세포 – 세포 상호 작용을 나타낸다.
주의 사항 및 생활 된 HUVEC에서 추적 MT 역학의 장점.
디스크 현미경을 회전하기에 좋은 방법입니다높은 시간 해상도와 공 초점 이미지 선명도를 필요로 실험 가설을 테스트합니다. 적절한 카메라와 레이저 모듈과,이 현미경의 접근 방식은 낮은 방출 형광에 민감하고 형광 현미경의 다른 유형에 비해 감소 광표백에 도움이 될 수 있습니다. 다른 다양한 종류의 세포에서 EB3 라벨링 방식을 사용하여 MT 성장 역학의 광범위한 측정을 생성하기 위해 필요로 중요한 것은이 방법은 또한 높은 시간 – 해상도 이미징 중등도 적합하다.
라벨의 EB3 방법론 MT 플러스 단부 성장 동안 형광 표지 이동 단말의 다른 방법에 비해 뚜렷한 장점을 보유하고, 또한 고유의 단점이있다. 예를 들어, 적극적으로 분해, 이동 단말의 인구 안정된 비 동적 이동 단말 (71 내지 74)의 인구 모두 포함하는 임의의 주어진 시간에 성장되지 않는 MT 어레이의 비율이 존재한다. EB3는 이동 단말이 두 집단 라벨 않을 것와따라서 이러한 두 집단의 기여는 실험 데이터의 분석에 포함되지 않는다. 전체 MT 배열을 평가하기위한 대체 방법은 형광 표지 된 이동 단말의 모든 인구로 통합하고, 성장 감소의 식별을 가능하게 튜 불린, 그리고 안정된 이동 단말의 표현에 초점을 맞추고있다. 그러나, 전체 MT 어레이 라벨링 미세 소관 조직 센터 (MTOC)으로 상기 셀의 중심에 인접 근처 MT 어레이의 비교적 높은 밀도의 세포 근처 아닌 MT 단부의 이미지 분석을 수행하는 단점이 만들어 주변 75-77. 살아있는 세포에 형광 튜 불린 형광 EB3와 이동 단말의 2 색 공동 라벨을 사용하여 실험 튜 불린 표지 이동 단말의 대부분은 또한 EB3 표지 (78)를 것을, 질적으로, 밝혀졌다. 또한, 형광 튜 불린으로 표시 이동 단말의 자동 추적하는 효율적인 방법이 없었다. 이 데이터의 폐기물 수집을 의미한다기 형광 튜 불린을 발현하는 세포에 MT 역학의 측정은 오류가 발생하기 쉬운하고 지루한 과정을 개별 이동 단말의 손 추적을 필요로한다. 그 결과, 표지 EB3 이동 단말의 자동 계산 분석이 다수의 세포 유형에 걸쳐 실험 체제 35,79 다양한 내에 MT 역학 실험에 적용 할 수있는 MT 동성을 측정하기위한 바람직한 방법이되었다.
HUVEC 형태학 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결.
세포 골격 연구자의 관점에서 볼 때, plusTipTracker 자동 추적 분석 한 매우 유용한 적응 측정하고 MT 성장 역학 모두 전체 셀과 지역 변화를 평가하는 기능입니다. 셀 편광되기위한 요구 사항은 방향 세포 이동을위한 필수적인 전제 조건이다. 같은 편광 신호 단서는 긴 방향 세포 이동 30,31,51,54,56,80,81 주요 운전 인자로 알려져있다으로 </> SUP. 예를 들면, VEGF 수용성 시그널링 분자가 내피 세포 유형 2,82-87에서 VEGF 큐 향해 액틴 중합 및 MT의 성장을 유도한다. 또한, (예를 들어, 규격 및 차원의 mechanosensing 용) ECM 물리적 상호 작용에 대한 응답으로, HUVEC를 로컬 맵 지형 돌기 신장 내의 MT 성장을 촉진하도록 조절함으로써 MT 역학을 조절하고,이 방향의 HUVEC 이동을 안내하는 역할 큐 5,31,88. 따라서, 세포 외 신호에 응답 큐 편광 골격 역학 국부 변화의 평가 실험의 필요성을 강조한다.
합니다 (EB3 방식을 사용) MT 성장 역학 HUVEC 세포 이동의 동시 실시간 세포 이미징은 이동 단말이 초의 타임 스케일에 성장하기 때문에 세포 형태 및 방향 이동의 변화는 시간의 시간 스케일로 발생하지만, 수행하기가 매우 어렵다. 그러나 두 프로세스가 긴밀하게 LINKE 있습니다디. 또, 제 2 시간 스케일상의 형광 표지 EB3 연속 신속한 촬영은 EB3 신호의 photobleaching에 리드. EB3 (1-2 분 취득 시리즈) 30 분마다 성공적이었다 짧은 촬상 시리즈를 수행하여이 문제를 해결하려고하지만 EB3 최적 발현했다 EC를 소수로 달성 될 수 있고, 그 악영향이 표시되지 않았다 반복 레이저 조명 (5)에 효과.
MT 성장 역학 세포 형태 및 이동의 변화에 기여하는 방법의 해석을 가능하게하는 다른 방법은이자 (ROI) 도구 (35) (프로토콜 6.6 참조)의 plusTipTracker 지역이다. 전체 셀 MT 성장 세분화 MT 성장 트랙 후 추출하여 분석 할 수있는 사용자 정의 된 영역으로 할 트랙이 방법은 허용한다. 예를 들어, 셀 '비 분지 "대 영역"분지 "의 비교는 이동 단말의 더 성장할 것으로 밝혀졌다낮은 더욱 지속적으로 지형 영역 내의 비 분지 셀 주변부 5 비교. 편광 상처 가장자리 된 HUVEC에서 리딩 에지와 트레일 링 에지 MT 성장 역학의 비교는 MCAK 유도 MT 분해가 트레일 링 에지를 최첨단 내에서 구체적으로 금지되지 않지만 것으로 나타났습니다. 선도 RAC1 및 / 또는 MCAK의 인산화 돌연변이 표현 된 HUVEC의 가장자리 MT 성장 역학 후행 지역의 평가는 더 오로라-A 키나아제의 RAC1 유도 활성화는 특히 로컬 HUVEC의 편광 방향 이동을 구동하기 위해 최첨단 내에서 MCAK 활동을 억제하는 것으로 나타났다 31. 따라서, MT 성장 역학과 지형 돌출부 및 / 또는 상처 가장자리 된 HUVEC의 최첨단에서 MT 성장 역학의 지역 평가의 자동화 된 추적의 조합은 우리가 HUVEC 형태 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결 할 수있다.
기술 된 프로토콜이다 고안d를 HUVEC 문화와 실험 조사를 위해 일반적으로 간단하고 매우 반복적 인 방법을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜 세부 여러 차례의 실험 방법을 수행하거나 오류 문제에 대한 기회를 제공하는 복잡하고 시간 소모적이다. 이 프로토콜을 통해 잠재적 인 문제를 해결하기 위해 시도하는 동안, 여기에 많이 사용하거나 다른 방법 프로토콜 내에서 노트로 약칭이다 잠재적 인 문제의 추가, 자세한 문제 해결을 제공한다.
폴리 아크릴 아미드 기판에 코팅 된 커버 (프로토콜 2.2), 커버 글라스를 활성화 유리에 폴리 아크릴 아미드 결합, 폴리 아크릴 아미드를 활성화 한 다음 폴리 아크릴 아미드에 ECM 커플 링의 복잡한 특성상 발생하는 일반적인 문제 관련. 하나 특히 어려운 잠재적으로 문제가있는 단계는 폴리 -A의 노출 다음 피브로넥틴 / 폴리 아크릴 아미드 겔에 HUVECs를 배양한다2 mM의 설포 SANPAH에 crylamide 코팅 된 커버 (위의 단계 2.2.2.6). 이는 이러한 기판상의 HUVEC를 배양의 성공에 중요 술포을-SANPAH 완전히 ECM 공액 다음 실험 시스템에서 제거 될 수있다. 이것은, DDH 2 O로 세척하고 밤새 진탕에 DDH 2 O의 커버 슬립을 배양하여 수행 할 수 있습니다. 폴리 아크릴 아미드의 ECM들에 배양 된 세포가 생존하지 않으면 생존이 예상 증가 및 피브로넥틴 (단계 2.2.2.9)에 접합 한 후 술포 SANPAH의 세척을 반복보다 작은 경우 잠재적으로이 문제를 완화하기 위해, 또는 추천합니다.
프로토콜 3 (커버 슬립에 대한 cDNA를 형질 감염 및 HUVEC 배양)에 관련된 전기 천공 절차의 성공에 큰 영향은 세포의 트립신 동안 모두 HUVEC를 취급이 체결 다음 플라스틱 플라스크에서 제거하는 것입니다 일렉트로 (위, 3.3-3.4 단계). 걱정하는 것이 중요합니다트립신에, 플라스크 (일반적으로 1-2 분)의 표면에 "올림"로 세포에 필요한 시간을 초과하지 않는 상태에서 완전히 HUVEC를 모니터링. 트립신 과도한 시간은 세포가 피브로넥틴 – 코팅 된 커버 (34 단계)로 도금 한 후, 기판에 부착하지 않을 때까지 통상적으로 실현되지 않은 HUVEC의 사망의 주요 원인이다.
일렉트로 버퍼에 긴 시간이 정지 할 때와 유사한 중요한 것은, HUVECs를 (대부분의 일차 전지 유형) 잘 지내지 않는다. 더 큰 규모의 실험을하는 동안, 사용자는 전기를 필요로 5 개 이상의 조건을 가지고 예를 들어, 하나-A-시 개별 튜브 펠렛 세포 (형질 전환 당 1 개의 튜브)를 유지하고, 이들을 혼합하는 것이 좋다 , 전기 이전에 즉시 전기 버퍼입니다. 이 방법은 전기 버퍼 최대화 HUVEC 생존의 배양 시간을 최소화한다. 또한, 전체 문화 미디어에서 즉시 구조는 CR이다itical 다음 전기. 일분 이상의 다음과 같은 전기의 구조 지연이 완료 HUVEC 죽음 근처에서 발생할 수 있으므로 피해야한다.
관련된 세포 이동 분석 (프로토콜 9), 매우 높은 밀도에서 HUVEC를 배양하는 기술은 피브로넥틴 피복 된 커버 슬립의 건조를 요구 (프로토콜 3에 기재되어 있음) 기존 HUVEC 세포 배양 방법의 (단계 9.2에 기재되어 있음) 임계 변형에 따라 커버 슬립은 매우 작은 면적으로 HUVEC 배양을 가능하게하기 위해서이다. 커버 슬립이 완전히 건조되지 않았거나 피브로넥틴 커버 슬립의 사전 코팅 (단계 2.1 또는 2.2) 경우 비효율적 인 경우 종종, 커버 슬립 상에 배치되고 상기 미디어 – 함유 세포가 그 표면 장력을 잃고로 확장된다 하여 커버 슬립에서 세포의 밀도를 감소 커버 슬립 가장자리. 이 잠재적 인 문제를 해결하는 한 가지 방법은 커버 슬립에서 다음 미디어를 대기음하는 것입니다5 ~ 10 분 동안 바이오 안전성 캐비닛의 뒷면에 (여전히 35mm 접시에) 커버 슬립을 배치합니다. 이러한 조정은 접시 건조 돕기 위해 캐비넷 내의 공기 흐름을 허용하도록 도울 수있다. 눈에 보이는 액체가 공기 건조 후 커버 슬립에 남아있는 경우, 액체 관광 명소를 대기음 다시 바이오 안전성 캐비닛에 5-10 추가 분 동안 공기 건조를 할 수 있습니다. 완전히 이러한 잠재적 문제점을 방지 할 수있는 방법이 없다는 것을 유의하는 것이 중요하지만,이 프로토콜의 반복 실시에 문제가 덜 않는다. 또한 세포 이동 분석 (또는 일반적으로 어떤 분석)에 대한 커버 슬립을 준비 할 때, 추가 된 커버를 준비하고 여분의 HUVECs를 준비 – 투 – 갈 길을 따라 문제가있는 경우에 가지고있는 문제 해결 권장합니다.
염두에두고 이러한 문제 해결 고려, 논의 된 프로토콜과 미래 세포 생물학 연구에 그 의미의 유용성을 강조하는 것도 중요합니다. polyacr에 적용아미드 접근 방식은 광범위하고, (전술) 세포 ECM 참여의 2 차원 연구뿐만 아니라 입체 조사 (5)뿐만 아니라이 포함되어 있습니다. 이 응용 프로그램은 HUVECs를 생리적 환경에서 세포의 모양과 이동을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해를 증가시키는 중요하며, 연구자들에게 세포 골격 변화를 조정하는 방법을 형태 학적 변화에 대한 기본적인 이해를 제공해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 MT 성장 동역학 측정에 집중하고 있지만, 프로토콜의 대부분은 세포 – ECM 상호 작용의 다른 측정 가능한 현미경으로 임의의 개수의 양상을 측정하도록 구성되어야 할 수있다. MT 역학에 대해, 제시된 프로토콜을 사용하여 조사 할 수있다 적어도 14 키네신 89 가족, HUVEC 극성 감독 마이그레이션에 기여의 잠재적 인 역할 각, 모든의를 포함하여, 다수의 MAP에가 있습니다.
미래 연구해야LSO 병에 걸린 상태 대 정상에서 세포 ECM 참여 대상으로 될 수있다. 여기서 제시 HUVEC 프로토콜 정상적인 혈관 항상성 과정 연구에 적용 할뿐만 아니라, 몇 가지 이름, 심장 질환, 망막 병증, 종양 성장 및 전이를 포함하여 질환 상태에있다. 내피 세포의 혈관 신생 혈관이 높은 공간 및 시간 해상도로 모니터링 할 수 있도록 세포 ECM 참여 연구에 수 현미경 연구와 의무 준수의 눈에 띄게 투명 ECM들과 폴리 아크릴 아미드 기판을 접합. 실험 방법의 이러한 종류의 이미 중요한 내피 세포의 모양, 극성, 이전의 차이 및 이들 프로세스 5,31,90을 조절 단백질의 효과를 나타 내기 위해 시작했다. 미래의 노력은 ECM 준수 및 차원의 mechanosensing의 조합이 대상과 세포 골격 역학을 조절하는 로컬 제어 단백질 역할을 할 수있다 방법을 식별하는 것을 목표로한다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
plusTipTracker MT 분석 소프트웨어 개발을위한 멘토링과이 연구에 사용 된 형광의 cDNA 구조의 대부분을 제공하는 토론, 미셸 베어드와 마이크 데이비슨 박사 클레어 M. 워터맨, 그리고 캐서린 애플게이트와 Gaudenz Danuser 특별 감사. 이 작품에서 KAM에 부여에 의해 부분적으로 지원되었다 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)와 국립 보건원 (NIH). (부여 : 4K22HL113069).
Materials
| Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
| 2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
| 3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
| 405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
| anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
| ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
| ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
| ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
| ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
| Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
| Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
| EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
| Fetal bovine serum 25 mL | |||
| Bovine brain extract 2.0 mL | |||
| Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
| Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
| Hydrocortisone 0.5 mL | |||
| Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
| Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
| HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
| HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
| Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
| Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
| Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
| Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
| Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
| Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
| Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
| Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
| Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
| Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| plusTipTracker | |||
| Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
| Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
| Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
| Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
| Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin | Corning | MT25053CI | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |
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