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医学

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

Published: July 29, 2016
doi:
10.3791/54259
, , , , , , , ,
1R&D Reagents,Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology,Oncotest GmbH

概要

Xenoinjertos de tumores humanos son vascularizado y infiltrada por células de origen de ratón durante la fase de crecimiento in vivo. Para evitar el sesgo causado por estas células contaminantes durante el análisis de aguas abajo, hemos desarrollado un método que permite el agotamiento completo de todas las células de ratón mediante clasificación celular magnética.

Abstract

El uso de modelos de líneas celulares in vitro para la investigación del cáncer ha sido una herramienta útil. Sin embargo, se ha demostrado que estos modelos no para imitar de forma fiable los tumores de pacientes en diferentes ensayos 1. Xenoinjertos de tumores humanos representan el estándar de oro en relación con la biología del tumor, el descubrimiento de fármacos, y la investigación de metástasis 2-4. Xenoinjertos de tumores se pueden derivar de diferentes tipos de material como líneas de células tumorales, tejido tumoral de tumores de pacientes primarios de 4 o tumores en serie trasplantados. Cuando se propagan in vivo, el tejido xenoinjertado se infiltra y vascularizada por las células de origen murino. Múltiples factores tales como la entidad tumor, el origen del material xenoinjertado, tasa de crecimiento y la región de trasplante influyen en la composición y la cantidad de células de ratón presentes en xenoinjertos tumorales. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, el grado de contaminación de células de ratón es muy variable.

Contaminating células de ratón deterioran significativamente análisis aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos. Como fibroblastos de ratón muestran eficacias de alta chapado y las tasas de proliferación, tienden a crecer demasiado cultivos de células tumorales humanas, especialmente la proliferación de las subpoblaciones lentamente. De células de ratón deriva de ADN, ARNm y proteínas componentes pueden sesgar el análisis de la expresión génica aguas abajo, la secuenciación de próxima generación, así como el análisis del proteoma 5. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado con el disociador tejido benchtop y clasificación de células magnético. Aquí, demostramos que las células diana humanas pueden ser puede ser obtenido con el grado de pureza mayor que 96% en menos de 20 min independiente del tipo de tumor.

Introduction

tumores humanos sólidos consisten en fisiológica múltiple, así como tipos de células neoplásicas. Ellos forman tejidos heterogéneos con estructuras biológicas complejas. Los procesos biológicos como la formación del tumor, la progresión y las respuestas hacia terapias aún no se comprenden totalmente. Modelos in vitro de cultivos celulares で representan una herramienta útil para estudiar y comprender la biología del tumor. Sin embargo, sólo pueden reflejar en parte estructuras y procesos que se encuentran en los tejidos tumorales. Modelos de tumores humanos preclínicos fiables y estables son un requisito previo para el desarrollo de fármacos anti-tumorales y terapias 4,6, así como para la comprensión de la biología del tumor y la interacción de células tumorales y su entorno.

Modelos de xenoinjerto de tumor humano derivadas de tumores primarios de pacientes muestran altas relaciones con el tejido de origen en relación con la arquitectura histológica, las interacciones con las estructuras micro-ambientales, potencial metastásico y las respuestas a los fármacos 7 </sup>. Incluso cuando xenoinjertos de tumor se derivan de las células cultivadas o líneas celulares que se asemejan más a tumores de pacientes, por lo tanto mostrando mayor validez en la mayoría de los ensayos de comparación con los modelos de cultivo celular in vitro. Estas características los convierten en el estándar de oro de los modelos preclínicos 4 hacen. Además de su aplicación en la investigación del cáncer, el xenotrasplante de células humanas en ratones también se utiliza con frecuencia en la investigación de células madre para determinar el potencial stemness y diferenciación de una población objetivo 8.

Se ha demostrado que la microvasculatura humana y células del sistema inmune humana se sustituyen en la propagación in vivo de tumores humanos 2,9. Factores tales como el subtipo de tumor, la tasa de crecimiento, y la región del trasplante tienen un gran impacto en el nivel global de la infiltración, así como la composición de los tipos de células de ratón encontrado. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, la cantidad y la composición de las células de ratón son muy variables.

Los análisis de aguas abajo de los tejidos xenoinjertados a menudo son desafiados por las células de origen murino. Los cultivos primarios de células tumorales humanas de xenoinjertos son frecuentemente cubiertas por los fibroblastos. Además dificulta la generación de líneas de células tumorales in vitro, ensayos de aguas abajo como las pruebas de citotoxicidad de drogas o farmacocinética están sesgados ya que jp la corrección silico para los efectos procedentes de la contaminación de las células de ratón no es posible en la mayoría de los casos. Más allá de eso, la diafonía sólo se ha dilucidado en parte entre los fibroblastos de ratón y células tumorales humanas tiene un impacto directo en los resultados experimentales de estudios 10. Por otra parte, la variación más ampliamente impredecible de la infiltración de células de ratón agrava los análisis moleculares precisos aguas abajo. En NGS o proteoma analiza cada señal derivada de ratón medido en lugar de una señal de tumor humano disminuye directamente la sensibilidad de secuenciación. También los análisis de microarrays de expresión basados ​​son desafiados por nuc murinoácidos transoleicos de hibridación posiblemente cruz para sondas humanos.

Con el fin de eludir los obstáculos de la contaminación de las células de ratón en los análisis posteriores de las células tumorales humanas a partir de modelos de xenoinjertos se han propuesto diferentes enfoques. En muchos estudios de células diana deseadas para el análisis de aguas abajo están aisladas mediante la utilización de marcadores o combinaciones de marcadores expresados ​​exclusivamente en células tumorales humanas. Sin embargo, la falta de marcadores fiables para la identificación positiva de las células tumorales humanas con frecuencia representa un gran obstáculo. Incluso marcadores expresados ​​en términos generales, como EpCAM en carcinomas humanos, con frecuencia muestran diferencias de expresión intrínseca del tumor 11. Esto aumenta el riesgo de que las subpoblaciones que expresan bajos, por ejemplo, células tumorales sufrido epitelial a mesenquimal transición, se pierden durante el aislamiento. Además, la unión directa de un agente de selección a la célula diana podría influir en los resultados de análisis subsiguientes. Los intentos de ozono células de ratónusando una combinación de anticuerpos específicos para CD45 murino y de clase epítopos del MHC I también se han hecho 12. Sin embargo, esta combinación de marcadores sólo detecta un subconjunto de células de ratón. Otro enfoque consiste en mejorar los procesos de análisis por software. Sin embargo, todos estos enfoques no son ya sea adecuado para cualquier tipo de configuración experimental o para cualquier entidad tumoral y el método de trasplante.

En este estudio se presenta un método novedoso y rápido para el ozono exhaustivamente las células de ratón a partir de tejidos xenoinjertados independientes de la cepa y tejido de origen de ratón. En exámenes en varios órganos diana y tejidos para trasplante de xenoinjertos (incluyendo la piel, pulmón, cerebro, riñón y músculo esquelético) hemos sido capaces de identificar una combinación de anticuerpos que permiten para la detección de células de ratón exhaustivamente. Estos anticuerpos se acoplaron a partículas superparamagnéticas, se titularon y optimizados para el agotamiento mediante el uso de clasificación de células magnético. Ya que sólo de ratón concretose utilizan los anticuerpos, las células diana humanas permanecen "sin tocar" y el método no se limita a tejido tumoral xenotransplantado. Demostramos que las células de ratón exhaustivamente la eliminación de las muestras tumorales xenoinjertados estandariza y facilita cultivos de células tumorales humanas. Además, se muestra que el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se mejora significativamente. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente. Tomados en conjunto, la eliminación de las células de ratón que utilizan este nuevo método facilita el cultivo de células tumorales humanas y mejora significativamente los análisis de aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices éticas y legales locales de Regierungspräsidium Freiburg Referat 35. 1. Preparación de los reactivos NOTA: Antes de comenzar el experimento, se preparan los siguientes reactivos del kit de disociación: Para preparar la enzima H disolver cada vial del polvo liofilizado en 3 ml de RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) o medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparar alícuotas adecuadas (por ejemplo, 200 l) y almacenar a – 20 ° C durante un máximo de 6 meses. Para preparar la enzima R disolver el vial del polvo liofilizado en 2,7 ml de RPMI o DMEM medio. Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparar alícuotas adecuadas (por ejemplo, 100 l) y almacenar a – 20 ° C durante un máximo de 6 meses. Para preparar enzima A disolver el vial del polvo liofilizado en 1 ml de Tampón A suministrado con el kit sin agitación. Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparan alícuotas adecuadas y almacenar a (por ejemplo, 25 l.) – 20 ° C durante un máximo de 6 meses. Asegúrese de mezclar bien esta suspensión inmediatamente antes de retirar el volumen de reacción requerida. Preparar 250 ml de tampón (1x PBS con 0,5% de BSA) para el procedimiento de separación de células y la tinción de anticuerpos. NOTA: Cuando el cultivo de células después de la eliminación de las células de ratón filtran todos los tampones y soluciones de enzimas a través de un filtro de 0,22 micras. 2. Tumor Protocolo de disociación NOTA: En este estudio xenoinjertos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) derivados del paciente, se utilizaron cáncer renal y la vejiga. Los tumores se generaron mediante la implantación de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer renal vejiga en 4 – 6 semanas de edad nu / nu ratones NMRI como se describió anteriormente 13 </sarriba>. NOTA: Como este protocolo es completamente independiente del tipo de tumor, que puede ser utilizado para cualquier tipo de paciente o tumor derivado de la línea celular, así como otros tipos de tejido xenotransplantado humano sin modificación del protocolo. Preparar 5 ml de la mezcla de digestión por muestra de tejido (hasta 1 g) recién mediante la adición de 4,7 ml de RPMI 1640 o DMEM, 200 l de enzima H, 100 l de enzima R, y 25 l de enzima A en un tubo de disociación celular ( C tubo). Asegúrese de mezclar bien la suspensión de la enzima R antes de retirar el volumen requerido. Sacrificar los animales por dislocación cervical bajo anestesia. Desinfectar ratón por pulverización con una pequeña cantidad de 80% v / v de etanol. tumor subcutáneo de la cosecha desde el flanco del ratón usando pinzas y tijeras en una campana de cultivo de tejidos. Cortar la piel abierta en lugar del tumor utilizando tijeras y luego separar el tumor del tejido sano adyacente uso de fórceps y tijeras. NOTA: En función de la finalidad deel experimento realizar este y los siguientes pasos en condiciones asépticas. En este estudio, todos los pasos se llevaron a cabo en una campana de cultivo de células en condiciones asépticas con el fin de ser capaz de cultivar las células. Preparar la muestra de tumor para digestiones mediante la eliminación de la grasa (ya que esto hará que el flotador de la muestra) y áreas de necrosis (ya que esto dará lugar a disminución de la viabilidad) cortando a la basura usando fórceps y un bisturí. Picar el tejido en trozos de 2 – 4 mm utilizando bisturís y pinzas. Transferir las piezas de tejido en el tubo C que contiene la mezcla de digestión. Cerrar el tubo C y asegúrese de que esté bien cerrado. Adjuntarlo al revés sobre el manguito del disociador de tejido de sobremesa y asegúrese de que las piezas de tejido se encuentran en la zona del rotor / estator. Elegir el modo "h_tumor_01" pulsando la tecla "arriba" o el botón "abajo" hasta que aparezca el modo en la pantalla y luego pulsando el botón "Inicio". Si tucantar la función de calentamiento del tejido disociador de sobremesa, asegúrese de adjuntar también el calentador. A continuación, ejecute el modo 37C_h_TDK_1 (para los tumores blandos), 37C_h_TDK_2 (para tumores medianos) o 37C_h_TDK_3 (para los tumores duros) haciendo clic en el símbolo de la carpeta en la pantalla táctil hasta que aparezca la carpeta "Miltenyi". Para elegir el modo, haga clic en la flecha hacia arriba o hacia abajo hasta que el modo de disociación se pone de relieve 37C_h_TDK_2. Las mangas de la disociador tejido de sobremesa se representan como posiciones en la pantalla del dispositivo. Elija las posiciones de las muestras se ejecutan en ellos haciendo clic en la pantalla táctil. Pulse el botón "Inicio" para ejecutar el modo y continúe con el paso 2.16. NOTA: En función del tipo de tumor otro programa de disociación podría ser adecuado (vea el paso 2.7.1). Observar una ventana que muestra "Terminación del programa" en la pantalla. Después de la terminación del programa, separar C de metro del tejido disociador de sobremesa. Incubar la muestra durante 30 min a 37° C bajo rotación continua, por ejemplo, mediante el uso de un rotador de tubo. Después de la incubación adjuntar C tubo boca abajo en el manguito del disociador de tejido de sobremesa. Una vez más asegurarse de que el material de la muestra se encuentra en la zona del rotor / estator. Ejecutar el programa h_tumor_02 disociación (para los tumores blandos y medios) o h_tumor_01 (para los tumores duros) como se describe en el paso 2.7.1. Después de la terminación del programa, separar C de metro del tejido disociador de sobremesa. Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C bajo rotación continua. Adjuntar C tubo boca abajo en el manguito del disociador de tejido de sobremesa después de la incubación. Una vez más asegurarse de que el material de la muestra se encuentra en la zona del rotor / estator. Ejecutar el programa h_tumor_03 disociación (para los tumores blandos), h_tumor_02 (para tumores medianos) o h_tumor_01 (para los tumores duros) como se describe en el paso 2.7. Para recoger el material de muestra en la parte inferior del tubo realizar un shoetapa de centrifugación rt (a 100 xg durante 10 sec). Resuspender las células y se aplican a un filtro de células con 70 micras de tamaño nesh colocado en un tubo de 50 ml. Lavar el filtro de células con 20 ml de RPMI 1640 o DMEM. suspensión de células Centrifugar a 300 xg durante 7 min. Aspirar el sobrenadante por completo. Resuspender las células en 5 ml de tampón para el recuento. Proceder con el ratón de la célula agotamiento de la separación celular magnética (sección 3). 3. El agotamiento de la célula de ratón por tecnología de separación celular magnética NOTA: Los volúmenes para el etiquetado magnética dan a continuación son para un máximo de 2 x 10 6 células tumorales o 10 7 células totales incluyendo las células rojas de la sangre. Dependiendo del tamaño del tumor el número de células más altos o más bajos se obtendrá. En el caso de un menor número de células, usar el mismo volumen como se indica. Cuando se utiliza el número de células superiores, ampliar todos los volúmenes de reactivos y volúmenes totales en consecuencia (por ejemplo, para 4 x 10 6 células tumorales o 2 x 10 <sup> 7 células totales, use dos veces el volumen de todos los volúmenes de reactivos indicados y los volúmenes totales). Determinar el número de células de una alícuota de la suspensión celular en el paso 2.21 usando un microscopio y cámara adecuada para el recuento. NOTA: En este punto la suspensión de células consiste en una mezcla heterogénea de células tumorales humanas así como estromales de ratón y las células sanguíneas, incluyendo las células rojas de la sangre. La composición de las células depende en gran medida del tipo de tumor y de la región para el trasplante. Al realizar el análisis de citometría de flujo después de la eliminación de las células de ratón retirar 100 ml de alícuotas a tubos adecuados para un sin teñir y para el análisis de citometría de flujo de dos sola tinción de control de color. Guárdelos en un refrigerador a 2 – 8 ° C hasta que nuevas medidas de tinción (sección 4). suspensión de células Centrifugar a 300 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 80 l de tampón por 2 x 10 6 células tumorales o 10 7células totales Añadir 20 l de reactivo de marcado magnética para células de ratón. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en el refrigerador (2 – 8 ° C). Durante el etiquetado magnético, preparar columnas a gran escala (LS columnas) para la separación magnética, mediante la colocación en el campo magnético de un imán adecuado (véase la Tabla de materiales y equipo) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Lavar la columna con 3 ml de tampón. Ajustar el volumen de la muestra a 500 l usando tampón para un máximo de 2 x 10 6 células tumorales o hasta 10 7 células totales. (Hasta 1 x 10 7 células tumorales o hasta 5 x 10 7 células totales pueden ser procesados ​​en una columna LS. Cuando se trabaja con más células dividió la muestra en múltiples columnas LS). Al realizar el análisis de citometría de flujo, análisis molecular o la comparación de fracciones en las culturas, se toma una alícuota de 50 l de la muestra como sin clasificar. Almacenarlo en un refrigerador a 2 – 8 ° C hasta su posterior procesamiento. </ Li> Aplicar 500 l de la suspensión celular en la columna preparada previamente. Suma de flujo continuo que contiene las células diana sin marcar, lo que representa las células tumorales humanas enriquecidas. NOTA: Cuando se trabaja con el número de células más altas de hasta 2,5 ml de suspensión celular que se preparó de acuerdo con el paso 3.5 se puede aplicar a una columna. Lavar la columna con 2 x 1 ml de tampón. Recoger las células que pasan a través y se combinan con el flujo a través de la etapa 3.6. Realizar las etapas de lavado mediante la adición de las alícuotas de 1 ml de tampón tan pronto como el depósito de la columna está vacía. NOTA: El flujo a través contiene células tumorales humanas purificadas. Para recoger también las células de ratón retenidas en la columna, quitar la columna del separador y colocarlo en un tubo adecuado. Pipeta de 3 ml de tampón en la columna y de inmediato el uso del émbolo para expulsar a las células de ratón presionando firmemente en la columna. Centrifugar las fracciones y muestras de control a 300 xg durante 10 min. supe Aspirarrnatant por completo y volver a suspender las células en tampón, medio de cultivo o congelar pellet en nitrógeno líquido, dependiendo de la aplicación deseada de aguas abajo. 4. Los análisis intermedios La tinción para el análisis de citometría de flujo NOTA: Antes de llevar a cabo análisis adicionales aguas abajo, una parte de las células obtenidas de procedimiento de reducción de células de ratón se puede analizar (por ejemplo, evaluar la pureza y de rendimiento) en citometría de flujo. Para los análisis de citometría de flujo, girar al menos 10% de la fracción negativa y positiva obtenida de procedimiento de separación celular magnética (sección 3), así como las muestras de control de la etapa 3.2 y 3.5 a 300 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular de las muestras de control de la tinción de la etapa 3.2 en 90 l de tampón. Resuspender las fracciones obtenidas de procedimiento de separación celular magnética en 80 l de tampón. Añadir 10 l de ratón FcR Reactivo de Parada a todosmuestras. Mezclar bien e incubar durante 5 minutos a 2 – 8 ° C en un refrigerador. Añadir 10 l de anti-EpCAM humana-PE (anticuerpo es igual a la dilución de 1:10) y 25 l de anti-ratón-APC cóctel (equivale a una dilución de anticuerpo de 1: 4) para las muestras de la sección 3. Añadir 10 l de lucha contra -humana EpCAM-PE a una muestra única de control de color (es igual a la dilución de anticuerpo de 1:10) y 10 l de anti-humano EpCAM-APC a la otra (es igual a la dilución de anticuerpo de 1:10). Mezcle todas las muestras y se incuba durante 10 minutos a 2 – 8 ° C en un refrigerador. NOTA: EpCAM no es adecuado como marcador de células del tumor de cualquier tipo de tumor. Para los tumores utilizadas en este estudio expresión EpCAM se conocía. Para lavar las muestras, añadir 1 ml de tampón de cada uno y de centrifugado a 300 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular a una concentración para el análisis de citometría de flujo. Para excluir las células muertas de añadir yoduro de propidio (1 mg / ml). Realizar análisis de citometría de flujo utilizando un f adecuadobajo citómetro de acuerdo con los protocolos del fabricante. El cultivo de células tumorales humanas NOTA: Además de la citometría de flujo, las células obtenidas a partir del procedimiento de separación pueden ser cultivadas y se utiliza para más ensayos in vitro. Resuspender la fracción ordenados de la sección 3 en medio de cultivo a una concentración de 5 x 10 5 células / ml. NOTA: En función del tipo de tumor recubrimiento, densidad de siembra adecuada, y las condiciones de cultivo pueden ser diferentes. Añadir 500 l de suspensión de células en los pocillos de una placa de 24 pocillos recubierta con 0,1% de gelatina. Se incuban las células en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y 5%. NOTA: condiciones de cultivo óptimas dependen del tipo de tumor usado. Por lo tanto, se aplican condiciones de cultivo adecuadas para el tipo de tumor usado. La tinción de inmunofluorescencia de las células cultivadas Preparar la solución de bloqueo mediante la adición de 10% de FCS y 0,1%Triton X-100 en 1X PBS. medio de cultivo de descarte. Añadir 500 l de 1x PBS por pocillo para lavar las células. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT), entonces descartar 1x PBS completamente. Fijar las células mediante la adición de 300 l de solución de PFA 4%. Incubar a TA durante 15 min. Desechar la solución de PFA. Lavar las células 3 veces fijos como se indica en el paso 4.3.2. Realizar la permeabilización y el bloqueo mediante la adición de 300 l de bloqueo por pocillo. Incubar a TA durante 30 min. Descartar la solución de bloqueo. Lavar las células como se indica en el paso 4.3.2. Añadir 300 l de anticuerpo primario diluido en solución a las células de bloqueo. Anti-humano anticuerpo EpCAM se diluye 1:40, anticuerpo vimentina se diluye 1: 200. Incubar toda la noche a 2 – 8 ° C. Nota: Los anticuerpos utilizados no son adecuados para cualquier tipo de tumor como EpCAM no podría expresarse en las células tumorales y / o vimentina también se expresa por las células tumorales. Asegúrese de que los anticuerpos utilizados son adecuados para el mes de xenoinjertosdel. Desechar la solución de anticuerpo primario. Lavar las células 3 veces como se indica en el paso 4.3.2. Añadir 300 l de anticuerpo secundario diluido en solución a las células de bloqueo. Ambos anticuerpos, anti-IgG de conejo-Alexe594 y anti-IgG de ratón-Alexa488 se diluyen 1: 400. Incubar durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Desechar la solución de anticuerpo secundario. Lavar las células 2 veces como se indica en el paso 4.3.2. Añadir 300 l de solución de DAPI (0,1 g / ml) a cada pocillo. Incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Desechar la solución DAPI. Lavar las células 3 veces como se indica en el paso 4.3.2. Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocillo. Realizar microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio adecuado. Secuenciación toda Exoma Para enteros pellets de congelación secuenciación del exoma (WES) de la etapa 3.9 en nitrógeno líquido. Tienda y tomar muestras a -80 ° C. Después de recoger las células, lleve a cabo la captura del exoma y toda siguientes exomauir de conformidad con las instrucciones del fabricante del kit correspondiente (véase la Tabla de Materiales y Equipos).

Representative Results

Se han propuesto diferentes enfoques para identificar o agotar las células de ratón a partir de xenotransplantes de tumores humanos, por ejemplo, una combinación de anticuerpos específicos de ratón contra CD45 y MHC de clase I. Sin embargo, sólo se detectaron las subpoblaciones de células de ratón usando estas combinaciones, mientras que la combinación propuesta detectado CD45 y MHC de clase I que expresan las células de ratón, así como el resto de las células de ratón que se encuentran en los tejidos diana para el trasplante (Figura 1). Utilizando esta nueva combinación de anticuerpos para la clasificación de células magnético, las células tumorales humanas se podían aislar independiente del tipo de tumor (Figura 2). Las células obtenidas a partir de la eliminación de células magnético de separación de células basada en el procedimiento de ratón podrían ser cultivadas, dando lugar a cultivos puros de células tumorales humanas (Figura 4). Además, las células de ratón viables se podrían obtener y cultivadas a partir de lamisma muestra. Además de la eliminación de las células de ratón, también los desechos se eliminó en el agotamiento de células de ratón (MCD) (Figura 3). El agotamiento completo de las células de ratón, así como los desechos de plomo retirada a la mejora de los análisis moleculares aguas abajo. Esto se demostró mediante la comparación de los resultados obtenidos a partir de la secuenciación del exoma (WES) realizados sobre piezas de tumor a granel y muestras de células de ratón empobrecido a partir de tres diferentes modelos de xenoinjertos tumorales derivadas del paciente (Figuras 5 – 9). Nuestros datos indican que la eliminación de las células de ratón antes de realizar WES en muestras de tumores de xenoinjertos aumenta no sólo significativamente la cantidad total de lecturas (Figura 5) sino que también reduce considerablemente el número de anfitrión deriva lee mapeado en el genoma de referencia humana (Figura 6B). A medida que estos ratón erróneamente asignada lee con frecuencia interfiere con llamadas SNP, se observó una fuerte reducción del valor teórico falsamenteSNPs después de MCD (Figuras 7-8). Por último, hemos demostrado que la eliminación in silico del derivado de ratón lee por métodos bioinformáticos no podría reemplazar totalmente el procedimiento experimental, como una inequívoca asignación basada en la secuencia de la especie de origen no era posible que todas las lecturas. Además, el procedimiento en silico no pudo corregir por la calidad mejorada y una mayor cobertura de lectura concomitante de la in vitro muestras empobrecido (Figura 9). Figura 1. El establecimiento de un cóctel de anticuerpos Reconociendo Todas las células de ratón a través de múltiples órganos 14. Proyecciones en múltiples órganos, incluyendo la piel, pulmón, cerebro, riñón y músculo esquelético, se han realizado. Estos órganos representan los principales tejidos diana para xenotrasplantes. Combinaciones tales como aquellos que reconocen mouSE CD45 y de clase epítopos del MHC I ya se han utilizado con el fin de agotar las células de ratón después de los xenotrasplantes. Sin embargo, estas combinaciones de marcadores reconocen sólo un subconjunto de células de ratón en todos los tejidos analizados. En exámenes anteriores una combinación de cinco anticuerpos ha sido identificado lo que permite la detección integral de todas las células de origen de ratón. Este panel incluye células rojas de la sangre y es independiente del tejido de origen (A, B, y los datos no se muestra). Modificado de 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. El agotamiento confiable y rápido de las células de ratón 15. Los conjugados de la combinación anticuerpo con superparamagnético nanoparticles se utilizaron para desarrollar un protocolo optimizado para el agotamiento de células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos por clasificación celular magnética (separación celular magnética) (A). Este nuevo protocolo permitió la eliminación de> 99% de contaminación de células de ratón en menos de 20 min, independientemente del tipo de tumor. Fracciones de células obtenidas a partir de procedimiento de separación celular magnética se marcaron con el cóctel de pan-anticuerpo de ratón y un anticuerpo específico humano contra CD326 (EpCAM) (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Aislamiento de células de glioblastoma humano. Ratón Kit depleción de células se utilizó para aislar células de glioblastoma humano de adulto mouse cerebro. Durante la disociación de grandes cantidades de tejido neural de los desechos se genera habitualmente. RDPQ reduce eficazmente las células muertas y los desechos, como se ve por el gráfico que muestra el tamaño de células frente a la granularidad celular. Con este cóctel conjugado, que era posible eliminar> 99% de las células de ratón contaminantes y> 60% de los escombros. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. El agotamiento de células de ratón Facilita culturas aguas abajo de células tumorales humanas 14. Fibroblastos de ratón con frecuencia obstaculizan el cultivo de células tumorales humanas después de la disociación de tejidos trasplantados o conducen a cultivos heterogéneos. Fibroblastos se adhieren y se expanden de manera más eficiente, por lo tanto overgrowing objetivo c ells. Esto perturba en ensayos de cultivo celular in vitro (por ejemplo, pruebas de citotoxicidad de drogas), ya que la corrección matemática de los efectos derivados de la contaminación de las células de ratón es imposible en la mayoría de los casos. El negativo (B) y las fracciones positivas (C) después de la depleción de células de ratón se cultivaron durante tres días, fijadas y teñidas de un marcador de ratón específicos de fibroblastos (vimentina) y el marcador de tumor humanos específicos de CD326 (EpCAM). Como control, la fracción original que contiene las células no separadas (A) se cultivó y se tiñó también. Incluso después de tres días de cultivo, se observó una población casi pura de células tumorales humanas en la fracción negativa (B), mientras que la fracción no seleccionados (A) era casi cubierto por los fibroblastos. Sólo una pequeña parte de las células diana se perdió a la fracción positiva (C). Modificado de 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5. Todo el exoma secuenciación (WES) de las muestras del tumor antes de y después de la depleción de células de ratón (MCD) 15. Se realizó WES en tres diferentes modelos de xenoinjertos derivados de riñón humano, pulmón y cáncer de vejiga con el fin de evaluar el impacto de MCD en la calidad de los datos de secuenciación de próxima generación. Se utilizó el ADN de tumor a granel y de las células tumorales aisladas después de la depleción de células de ratón para generar bibliotecas de secuenciación del exoma-capturado aplicando una unidad de captura exoma. Para la secuenciación en un secuenciador instrumento de escritorio, un kit de reactivos secuenciador de escritorio 150 ciclos, se utilizó para generar 75 pb de extremo emparejado lee. Un aumento significativo (p <0,05) en la densidad del clúster (A), así como un aveSe observó un aumento en el recuento de la rabia de lectura de 33% (B) para las muestras agotados de células de ratón, lo que indica una mejor calidad de la muestra. En consecuencia, una fuerte reducción de los desechos y células muertas sobre MCD también se pudo demostrar por citometría de flujo análisis (véase la Figura 3). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. El agotamiento de la célula de ratón (MCD) reduce mucho Número de ratón erróneamente asignada Lee después de que todo Exoma Secuenciación (WES) 15. Como oligonucleótidos de captura utilizados para el enriquecimiento selectivo de secuencias codificadoras de proteínas se diseñaron basándose en el genoma humano, un pre-inicial enriquecimiento de fragmentos de ADN de origen humano from se esperaba que la mezcla de células de ratón y humanas. Con el fin de evaluar el número de oligonucleótidos de captura que podrían hibridación cruzada con el ADN genómico de ratón, se realizó búsquedas BLAST de cada sonda de captura exoma rápida solo contra genoma del ratón. Se utilizaron los parámetros de alineación resultantes para determinar la posible hibridación cruzada. (.. Alineación de longitud, ninguno de los desajustes, ninguna de las lagunas) en función de los umbrales de selección, que predijo una reactividad cruzada sobre 5 – 10% de las sondas de captura con transcripciones de ratón (datos no mostrados). Tras el recorte adaptador (v0.32 trimmomatic 16), estudiamos las lecturas de todas las muestras contra los genomas humanos y de ratón (BWA v0.7.12 17) y se determina su origen putativo basa en los respectivos parámetros de alineación (shell de Linux, la línea de comandos Perl) (A). Un promedio de 12% de lecturas derivadas de muestras de tumores a granel se atribuyó a las células de ratón. Esta cantidad podría reducirse a 0,3% en el agotamiento previo de células de ratón (B </strong>). Como en promedio 15% de la derivada de ratón lee asignada erróneamente con el genoma humano, correspondiente a 1,9% del total lee en las muestras tumorales granel y 0,04% en las células tumorales aisladas, una fuerte influencia positiva de la depleción de células de ratón en análisis posteriores se puede esperar. la Figura 6B es un ejemplo de la asignación de lectura detallada de tumor a granel y las células tumorales humanas aisladas derivadas del xenoinjerto de cáncer de vejiga. Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7. MCD reduce mucho el número de SNPs falsamente predichos 15. Con el fin de determinar el impacto de ratón lee mapeado en el genoma humano, se determinó el número de predicteD SNPs para las muestras de xenoinjerto antes y después de la MCD. Como estaba disponible para la comparación no tejido sano, un SNP se define como una diferencia entre la muestra y secuenciado el genoma de referencia (hg19). Después de la eliminación de lecturas duplicadas, SNP y INDEL llamada se llevó a cabo el 18 y estaba restringida a las regiones seleccionadas por una unidad de captura exoma. 63 ± 10% de todos los SNPs predicho para las muestras tumorales a granel ya no se detectaron después de la depleción de células de ratón, 18 ± 1% eran específicos para las células tumorales humanas aisladas (A). Mientras que los primeros fueron causadas principalmente por el ratón erróneamente asignada lee este último parecía ser detectados debido a los mayores recuentos de lectura y en consecuencia la cobertura más alta dentro de las muestras aisladas de células tumorales humanas. Este efecto también era visible para los INDEL predichos (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura. Figura 8. MCD mejora la predicción de alto impacto SNPs 15. (A) Impacto de la MCD en la predicción SNP dentro de un exón codificante de la proteína del gen POLA1 19 se ejemplifica. Mientras ratón erróneamente asignada lee causó un número de SNPs falsamente predichos en el xenotrasplante de cáncer de riñón a granel, estos SNP estaban desaparecidas después de MCD. Además, MCD también mejoró la predicción de alto impacto SNPs. Por ejemplo, ratón lee asigna al genoma de referencia humana en la muestra de tumor a granel como resultado la destrucción predicho erróneamente del codón de inicio del gen GRIA3 (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <p clas s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 9. En silico El agotamiento de ratón derivada de las lecturas no puede reemplazar completamente E n Vitro MCD 15. El lee prevé que sea de origen de ratón fueron retirados computacional de los datos de secuenciación, y se repitió la llamada SNP. Por este método, el número de SNPs predicho para las muestras tumorales a granel se redujo considerablemente de 63% a 8,5% del número total de SNPs (comparar con la Figura 8). Sin embargo, este enfoque en silico no puede sustituir completamente en MCD vitro, especialmente si la calidad de la muestra mejorada y el aumento concomitante en recuentos de lectura y la cobertura se consideran. Modificado de 15."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado y la clasificación de células magnético. Además de agotamiento de todas las células de ratón también la cantidad de células muertas y los desechos se reduce significativamente en la fracción de células diana. En conjunto, este método mejora significativamente análisis aguas abajo moleculares y cultivo de células tumorales humanas.

En contraste con los métodos alternativos, no hay necesidad de conocimiento de marcadores específicos de células tumorales, el ajuste a las diversas composiciones de células de ratón o establecimiento de algoritmos. El método presentado es independiente de la cepa de ratón y el tipo de tumor. Por lo tanto, un sesgo a través del aislamiento de subpoblaciones de tumores humanos sobre la base de marcadores específicos humanos individuales que pueden variar en la expresión, como se muestra para EpCAM 11, es evitared. Además, no está limitado a material de tumor pero se puede utilizar para cualquier tipo de tejido xenotransplantado como células de ratón están dirigidos en lugar de subpoblaciones específicas de tumores humanos (datos no mostrados).

la eliminación completa de las células de ratón se ve facilitada por la orientación epítopos de superficie expresados ​​exclusivamente en células de origen murino. Aparte del método bien establecido para la disociación tumor tal como se presenta en este estudio, hay muchos procedimientos que utilizan diferentes tipos de enzimas. La preservación de epítopos de la superficie celular es un requisito previo para este nuevo método, sino también para análisis precisos de las poblaciones de células tumorales humanas. Por lo tanto, es crucial que las enzimas suaves se utilizan para la digestión del tejido tumoral. Por lo tanto, el agotamiento de células de ratón se puede utilizar solamente en combinación con procedimientos de digestión enzimáticos que, evidentemente, no afectan a epítopos específicos durante el procedimiento de reducción de células de ratón. En caso de duda, esto sólo puede ser verificada por el fabricante respectivo.

<pclass = "jove_content"> Este método también funciona para las células tumorales circulantes (CTC) humanos. Sin embargo, como las frecuencias de las células diana son generalmente <0,1% de eliminación de las células de ratón requiere, además, la lisis de glóbulos rojos y purezas de más de 50% no se puede esperar. En este caso, el agotamiento de células de ratón se puede utilizar como pre-enriquecimiento de CTC seguido de un enriquecimiento usando marcadores positivos (datos no presentados).

La eliminación de las células de ratón mejora significativamente el cultivo de células tumorales humanas, evitando overgrow cultivo de fibroblastos de ratón. Además, el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se ha mejorado y estandarizado de manera significativa. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana específica se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente.

Por otra parte, el método presentado facilita AccuraLos estudios moleculares del te de subpoblaciones tumorales en tumores humanos xwnotransplantado. La eliminación de las células de ratón a partir de una muestra respectiva en la primera etapa y, posteriormente, la clasificación células tumorales humanas en dos subpoblaciones diferentes permite la comparación molecular directo de la subpoblación tumor de interés a las células tumorales a granel humano 20. La expresión génica diferencial entre los subtipos de células tumorales se puede evaluar de forma más fiable, ya que no se ve afectada por la hibridación cruzada de moléculas derivadas de ratón.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.

Materials

Tumor Dissociatio Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions
RPMI 1640 Biowest L0501-500
gentleMACS C-Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
MACS SmartStrainer (70 µm) Miltenyi Biotec 130-098-462
Petri dish 100 mm Various
Scalpel Various
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi Biotec 130-104-694
PBS Various use 1x PBS for PEB buffer
EDTA Sigma-Aldrich 3610 use final concentration of 2 mM in PEB buffer
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376 or use 5 mg/L BSA in PEB buffer
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
PreSep filters (70 µm) Miltenyi Biotec 130-095-823
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
CD326-FITC, human Miltenyi Biotec 130-080-301 use 1:40 for immunofluorescence staining 
anti-Vimentin antibody abcam ab92547
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 Life Technologies A11029
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 Life Technologies A11012
DAPI Sigma-Aldrich D9542 dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate 
Inside Stain Kit Miltenyi Biotec 130-090-477 InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining 
FBS Various
Triton X-100  Sigma-Aldrich 93418
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi Biotec 130-092-575
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100g
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit Illumina FC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3001
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参考文献

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Agorku, D. J., Tomiuk, S., Klingner, K., Wild, S., Rüberg, S., Zatrieb, L., Bosio, A., Schueler, J., Hardt, O. Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells. J. Vis. Exp. (113), e54259, doi:10.3791/54259 (2016).
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