İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir
概要
Insan tümör ksenograftlarının vaskülarize ve in vivo olarak büyüme aşamasında, fare kökenli hücreleri tarafından filtre edilemeyen bulunmaktadır. aşağı analizi sırasında bu kirletici hücrelerinin neden olduğu önyargı aşmak için, biz manyetik hücre sıralama tarafından tüm fare hücrelerinin kapsamlı tükenmesi için izin veren bir yöntem geliştirdi.
Abstract
Kanser araştırmaları için in vitro hücre çizgisi modellerinin kullanımı yararlı bir araç olmuştur. Bununla birlikte, bu modeller güvenilir bir şekilde çeşitli deneyleri 1 hasta tümörleri taklit etmek için başarısız olduğu gösterilmiştir. Insan tümör ksenogrefleri tümör biyolojisi, ilaç keşfi ve metastaz araştırması 2-4 göre altın standardını temsil etmektedir. Tümör ksenograftlarının tümör hücre çizgileri, primer hastanın tümör 4 ya da seri transplante tümörlerin tümör dokusu gibi farklı malzeme türlerinden elde edilebilir. In vivo yayılır zaman ksenogreflenmiş doku sızmış ve fare kökenli hücreler tarafından vaskülarize edilir. Tümör varlık olarak birden fazla faktör, transplantasyon Aşılanmış malzeme, büyüme hızı ve bölgenin kökeni bileşimini ve tümör xenogreftler mevcut fare hücrelerinin miktarını etkiler. Bununla birlikte, bu faktörler sabit tutulduğu zaman bile, fare hücre kirlenme derecesi oldukça değişkendir.
Contaminating fare hücreleri önemli ölçüde insan tümör ksenograftlarının alt analizler bozar. Fare fibroblastlar yüksek kaplama etkinliklerinin ve çoğalma oranları gösterdiği gibi özellikle yavaş subpopülasyonunun çoğalan insan tümör hücreleri kültürleri büyümek eğilimindedir. Fare hücre DNA, mRNA türevi, ve protein bileşenlerinin kutuplanacağını, aşağı doğru gen ifade analizi, yeni nesil dizi, hem de proteom analizi 5. Bu sınırlamaları aşmak için, ksenogreflenmiş tümör dokusundan el değmemiş insan tümör hücreleri izole etmek için hızlı ve kolay bir yöntem geliştirdik. Bu prosedür, tezgah üstü, doku ayrıştırıcı ve manyetik hücre sıralama ile otomatik bir doku ayrışmasını birleştirerek Fare kaynaklı hücreler kapsamlı tükenmesi dayanmaktadır. Burada, insan hedef hücreler tümör tipinden bağımsız az 20 dakika içinde saflık daha yüksek,% 96 elde edilebilir olabilir göstermektedir.
Introduction
Katı insan tümörleri çok fizyolojik ve neoplastik hücre tipleri içerir. Onlar karmaşık biyolojik yapıları ile heterojen dokuları oluştururlar. Biyolojik tümör oluşumu, ilerlemesi gibi süreçler ve tedaviler doğru yanıtları henüz tam olarak anlaşılamamıştır. In vitro hücre kültürü modelleri incelemek ve tümör biyolojisi anlamak için yararlı bir araç temsil etmektedir. Ancak, yalnızca kısmen tümör dokularında bulunan yapıları ve süreçleri yansıtabilirsiniz. Güvenilir ve istikrarlı preklinik insan tümör modelleri anti-tümör ilaçların ve tedavilerin 4,6 gelişmesi yanı sıra tümör biyolojisi ve tümör hücreleri ve bunların çevre etkileşimini anlamak için bir önkoşuldur.
Birincil hasta tümörlerinden türetilmiş beşeri tümör ksenogreft modelinde ilaç 7 mikro çevresel yapılar, metastatik potansiyelin ve yanıtları yüksek histolojik mimari için kaynak dokuya ilişkileri etkileşimleri gösterir </sup>. Tümör ksenograftlarının nedenle, in vitro hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında en çok deneylerde daha geçerliliği gösteren kültürlenmiş hücreler veya hücre çizgileri daha yakından hasta tümörleri taklit türetilen bile. Bu özellikler onları klinik öncesi modellerde 4 altın standart olun. Kanser araştırmalarında uygulanması yanı sıra, fareler, insan hücreleri ksenonakli de sık bir hedef popülasyon, 8 stemness ve farklılaşma potansiyelini belirlemek için kök hücre araştırma kullanılır.
Bu, insan mikrovaskuleterini gösterilmiştir ve insan bağışıklık hücreleri, insan tümörlerinin 2,9 in vivo yayılması sırasında değiştirilir. Böyle transplantasyon tümör alt tipi, büyüme oranı ve bölgenin gibi faktörler önemli sızma küresel düzeyde etkileri yanı sıra bulundu fare hücre tiplerinin bileşime sahip. Bununla birlikte, bu faktörler sabit tutulduğu zaman bile, miktarı ve fare hücreleri bileşimi oldukça değişkendir.
ksenogreflenmiş dokuların Mansap analizleri genellikle fare kökenli hücreler tarafından zorlanmaktadır. xenografts insan tümör hücrelerinin primer kültürleri sık fibroblastlar tarafından büyümüş. In vitro olarak tümör hücresi hatlarının üretilmesini engelleyen Bunun yanı sıra, bu gibi ilaç sitotoksisite testi veya farmakokinetik gibi akış aşağı deneyler Fare hücreleri kirletici çoğu durumda imkansız kaynaklanan etkileri siliko düzeltme yana bastırılmaktadır. Bunun ötesinde, fare fibroblastlar ve insan tümör hücreleri arasındaki tek kısmen açıklığa cross-talk çalışmalarının 10 deneysel sonuçları üzerinde doğrudan etkisi vardır. Ayrıca, fare hücrelerini infiltre en yaygın öngörülemeyen varyasyon doğru moleküler aşağı analiz ağırlaştırmaktadır. NGS veya proteom doğrudan sıralama duyarlılığını azaltan bir insan tümör sinyalinin yerine ölçülen her bir fare kaynaklı sinyal analiz eder. Ayrıca mikroarray tabanlı ifade analizleri fare MBK tarafından meydanLeic asitler insan prob muhtemelen çapraz hibritleşme.
farklı yaklaşımlar önerilmiştir ksenograft modelleri insan tümör hücrelerinin alt analizler fare hücreleri kirletici engelleri aşmak için. Birçok çalışmada alt analiz için arzu edilen hedef hücreler özel olarak insan tümör hücreleri üzerinde ifade işaretleri veya belirteçlerin birleşimlerin değerlendirilmesi yolu ile izole edilir. Bununla birlikte, insan tümör hücreleri pozitif tanımlanması için güvenilir bir belirteç olmaması sık büyük bir engel oluşturmaktadır. Bu tür insan karsinom üzerinde EpCAM bile geniş ifade belirteçler, sık sık tümör içsel ifade farkları 11 göstermektedir. Bu düşük ifade subpopülasyonunun, örneğin, tümör hücreleri, izolasyon sırasında epitel-to-mezenkimal geçiş kaybolur geçirmiş riskini artırır. Buna ek olarak, bir hedef hücreye bir seçim ajanı doğrudan bağlanma daha sonra analiz sonuçlarını etkileyebilir. fare hücrelerini tüketen girişimlerimurin CD45 ve MHC sınıf I epitop için spesifik antikorların bir kombinasyonu kullanılarak da 12 yapılmıştır. Bununla birlikte, bu markör kombinasyonu yalnızca fare hücrelerinin bir alt kümesini tespit eder. Başka bir yaklaşım yazılım tarafından analiz süreçleri geliştirmektir. Bununla birlikte, bütün bu yaklaşımlar da deney düzeneği herhangi bir ya da her türlü tümör taraf ve nakli yöntemi için uygun değildir.
Bu çalışmada kapsamlı fare zorlanma ve menşe doku bağımsız ksenogreflenmiş dokulardan fare hücreleri tüketen bir roman ve hızlı bir yöntem sunar. (Deri, akciğer, beyin, böbrek, iskelet kas dahil olmak üzere), ksenograftlarının nakli için birden fazla hedef organ ve dokularda gösterimleri olarak kapsamlı olarak, fare hücrelerinin tespit edilmesi için izin antikor kombinasyonu tespit mümkün. Bu antikorlar, süperparamanyetik partiküllere bağlı titre ve manyetik hücre sınıflandırma ile tükenmesi için optimize edildi. Sadece fareye özgüantikorlar, insan hedef hücreler "el değmemiş" kalmak kullanılır ve metot ksenonakledilmiş tümör dokusu ile sınırlı değildir. ksenogreflenmiş tümör örnekleri standartlaştıran ve insan tümör hücreleri kültürleri kolaylaştırır biz o kapsamlı kaldırma fare hücrelerini göstermektedir. Ayrıca, yeni nesil dizilemesi, insan tümör ksenograftlarının analizi önemli ölçüde geliştirilmiş olduğunu göstermektedir. İnsan dizisi, belirli bir seçim exome zenginleştirme sırasında gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen bu etki gözlenmiştir gibi, tüm genom ve bütün transcriptome sekanslama etkileyen daha da belirgin olması beklenmektedir. Birlikte ele alındığında, bu yeni yöntem ile fare hücreleri uzaklaştırılması insan tümör hücrelerinin ekimi basitleştirmekte ve insan tümör ksenograftlarının alt analizler geliştirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu ksenogreflenmiş tümör dokusundan bakir insan tümör hücreleri izole etmek için hızlı ve kolay bir yöntem geliştirdik. Bu işlem otomatik bir doku ayrışmasını ve manyetik hücre sınıflandırma birleştirerek Fare kaynaklı hücreler kapsamlı tükenmesi dayanmaktadır. Ayrıca, tüm fare hücreleri ölü hücreler ve artıkların miktarı tükenmesi yanı sıra önemli ölçüde hedef hücre fraksiyonu azalır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem önemli ölçüde moleküler alt analizler, insan tümör hücreleri yetiştirme artırır.
Alternatif yöntemlerin aksine, tümör hücresi spesifik belirteçler, fare hücreleri ya da algoritma kurulması bileşimleri değişen ayarlama bilgisine gerek yoktur. sunulan yöntem fare zorlanma ve tümör türü bağımsızdır. Bu nedenle, EpCAM 11 için gösterildiği gibi, ifade değişebilir tek insan spesifik belirteçler temelinde insan tümör alt popülasyonlarının izolasyonu sayesinde bir önyargı, önlemek olduğunuEd. Bundan başka, tümör madde ile sınırlı değildir, ancak fare hücreleri yerine belirli bir insan tümör alt popülasyonlarının hedef olarak ksenonakledilmiş doku türleri için kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir).
fare hücreleri Kapsamlı çıkarılması özel fare kökenli hücreler üzerinde ifade yüzey epitopları hedefleyen ile kolaylaştırılır. Dışında bu çalışmada sunulan tümör ayrılma için köklü yöntemi, enzimlerin farklı türde kullanarak birçok prosedürler vardır. hücre yüzeyi epitoplarının korunması, bu yeni yöntem, aynı zamanda, insan tümör hücre popülasyonlarının hassas analizler için bir ön koşuldur. Nedenle, yumuşak enzimler tümör dokusunun sindirimi için kullanılan son derece önemlidir. Bu nedenle, bir fare hücre tüketimi, sadece belirgin bir fare hücre tüketimi işlemi sırasında hedeflenen epitopları etkilemez enzimatik sindirim işlemleri ile bir arada kullanılabilir. Şüphe durumunda bu sadece ilgili üretici tarafından kontrol edilebilir.
<pclass = "jove_content"> Bu yöntem aynı zamanda insan dolaşımdaki tümör hücreleri (KTC) için çalışır. Bununla birlikte, hedef hücrelerin frekansları genellikle gibi <fare hücreleri% 0.1 çıkarılması ek beklenemez kırmızı kan hücrelerinin lisisi ve% 50'den daha fazla bir saflık gerektirir. Bu durumda, bir fare hücre tüketimi pozitif işaretleyiciler kullanılarak bir zenginleştirme ardından kapalı zaman eğrilerinin ön zenginleştirme olarak kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir).fare hücreleri çıkarılması önemli ölçüde fare fibroblastlarının kültürü kaplamak kaçınarak, insan tümör hücrelerinin kültür artırır. Buna ek olarak, yeni nesil dizilemesi ile insan tümör ksenograftlarının analizi önemli ölçüde geliştirilmiş ve standartlaştırılmıştır. Hedeflenen insan dizi-spesifik seçim exome zenginleştirme sırasında gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen bu etki gözlenmiştir gibi, tüm genom ve bütün transcriptome sekanslama etkileyen daha da belirgin olması beklenmektedir.
Ayrıca, sunulan yöntem sahih kolaylaştırırksenonakledilmiş insan tümörlerinin içinde tümör alt popülasyonlarının te moleküler çalışmalar. Iki farklı alt popülasyonlannda insan tümör hücrelerini sıralama birinci aşamada ilgili bir örnek, fare hücrelerinin çıkarılması ve daha sonra, insan dökme tümör hücreleri 20 çıkar, tümör alt popülasyonunun doğrudan molekül karşılaştırmasını sağlar. Bu fare-türevli moleküllerin çapraz melezleşme etkilenmez tümör hücresi alt tipleri arasındaki diferansiyel gen ekspresyonu daha güvenilir bir tespit edilebilir.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Materials
| Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
参考文献
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. . Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , (2014).
- Agorku, D., et al. . Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. バイオインフォマティクス. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. バイオインフォマティクス. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
