Человеческие ксенотрансплантаты опухоли и развитую сосудистую сеть инфильтрирована клетками мыши происхождения во время фазы роста в естественных условиях. Чтобы обойти смещение, вызванное этими загрязняющими клетками во время ниже по течению анализа, мы разработали метод, позволяющий для полной истощению всех клеток мыши с помощью магнитной сортировки клеток.
Использование в пробирке моделей клеточных линий для исследований рака является полезным инструментом. Тем не менее, было показано , что эти модели не могут надежно имитировать опухоли пациента в различных анализах 1. Человеческие ксенотрансплантаты опухоли представляют собой золотой стандарт в отношении биологии опухоли, открытия новых лекарств, а также исследования метастаза 2-4. Ксенотрансплантатов может быть получена из различных типов материалов , таких как линии опухолевых клеток, опухолевых тканей от первичных опухолей пациента 4 или последовательно перевиваемых опухолей. Когда размножают в естественных условиях, ксенотрансплантированной ткань пропитывается и васкуляризации клетками мыши происхождения. Несколько факторов, таких как лица, опухоли, происхождение ксенотрансплантированной материала, скорости роста и области трансплантации влияет на состав и количество клеток мыши, присутствующих в опухолевых ксенотрансплантатов. Тем не менее, даже когда эти факторы остаются постоянными, степень загрязнения клеток мыши сильно варьирует.
Колорадоntaminating клетки мыши значительно снижают вниз по течению анализа ксенотрансплантатов опухолей человека. Как фибробласты мыши показывают высокий металлизации эффективностями и скорость пролиферации, они имеют тенденцию разрастаться культуры опухолевых клеток человека, особенно медленно пролиферирующих субпопуляции. Клеток мыши получена ДНК, мРНК и белковые компоненты могут предвзятость анализ экспрессии генов вниз по течению, следующего поколения секвенирования, а также анализ протеома 5. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали быстрый и легкий метод, чтобы изолировать нетронутые опухолевых клеток человека из ксенотрансплантированной ткани опухоли. Эта процедура основана на комплексном истощению клеток мышиной происхождения путем объединения автоматизированной диссоциацию ткани с диссоциатора Benchtop ткани и магнитной сортировки клеток. Здесь показано, что клетки-мишени человека может быть может быть получена с чистотами выше 96% в течение менее чем 20 мин независимо от типа опухоли.
Солидные опухоли человека состоят из нескольких физиологических, а также опухолевые типов клеток. Они образуют разнородные ткани со сложными биологическими структурами. Биологические процессы , такие как опухоли формирования, прогрессии и ответы по отношению к терапии еще до конца не изучены. В пробирке модели культивирования клеток представляют собой полезный инструмент для изучения и понимания биологии опухоли. Тем не менее, они могут лишь частично отражают структуры и процессы, обнаруженные в опухолевых тканях. Надежные и стабильные доклинические модели опухолей человека являются предпосылкой для развития противоопухолевых препаратов и методов лечения 4,6, а также для понимания биологии опухоли и взаимодействие опухолевых клеток и их окружением.
Модели опухолей человека ксенотрансплантата , полученные из первичных опухолей пациентов показывают высокие отношения к ткани происхождения относительно гистологического архитектуры, взаимодействия с микро-экологических структур, метастатический потенциал и ответы к лекарственным средствам 7 </sup>. Даже тогда , когда опухолевые ксенотрансплантаты получают из культивируемых клеток или клеточных линий , они более близко имитируют опухоли пациента, поэтому свидетельствуют об улучшении показателей надежности в большинстве анализов по сравнению с в пробирке моделей клеточных культур. Эти особенности делают их золотым стандартом доклинических моделей 4. Кроме того , его применение в исследовании рака, ксенотрансплантации человеческих клеток в организм мышей также часто используется в исследованиях стволовых клеток для определения стволовости и дифференциации потенциала целевой группы населения 8.
Было показано , что человеческий микроциркуляторного русла и иммунные клетки человека заменяются при распространении в естественных условиях опухолей человека 2,9. Такие факторы, как подтипа опухоли, скорости роста и области трансплантации оказывает значительное воздействие на глобальном уровне инфильтрации, а также состав типов клеток мыши нашли. Тем не менее, даже когда эти факторы остаются постоянными, количество и состав клеток мыши сильно варьируют,
Downstream анализ ксенотрансплантированной тканей часто оспаривается клетками мышиной происхождения. Первичные культуры опухолевых клеток человека из ксенографтов часто зарастают фибробластами. Кроме того , затрудняя поколение опухолевых клеточных линий в пробирке, вниз по течению анализы , такие как тестирование на цитотоксичность лекарственного средства или фармакокинетики смещаются , так как в коррекции силикомарганца для эффектов , происходящих от загрязнять клеток мыши в большинстве случаев невозможно. Помимо этого, лишь частично выяснены наводок между мышиных фибробластов и опухолевых клеток человека оказывает непосредственное влияние на экспериментальных результатов исследований 10. Кроме того, наиболее широко непредсказуемый вариант инфильтрации клеток мыши обостряет анализы точные молекулярные вниз по течению. В NGS или протеомом анализирует каждый мыши полученный сигнал, измеренный вместо сигнала опухоли человека непосредственно снижает чувствительность секвенирования. Также анализ экспрессии микрочипов на основе бросает вызов мышиного писLEIC кислоты, возможно, крест гибридизации с зондами человека.
Для того, чтобы обойти препятствия загрязняя клетки мыши в нижнем течении анализа опухолевых клеток человека из ксенотрансплантатных моделей были предложены различные подходы. Во многих исследованиях желательные клетки-мишени для анализа вниз по течению выделяют путем использования маркеров или комбинаций маркеров экспрессируется исключительно на опухолевых клетках человека. Тем не менее, отсутствие надежных маркеров для положительной идентификации опухолевых клеток человека часто представляет собой большое препятствие. Даже широко выраженные маркеры, такие как EpCAM на карциномах человека, часто показывают опухоли внутренней экспрессии различия 11. Это увеличивает риск того, что низкий , выражающие субпопуляции, например, опухолевые клетки эпителиального подвергшийся к мезенхимальных перехода, теряются в процессе выделения. Кроме того, прямое связывание селективного агента к клетке-мишени могут повлиять на последующие результаты анализа. Попытки истощению клеток мыши с помощьюс использованием комбинации антител , специфичных к мышиным CD45 и I эпитопов ГКГ класса также были сделаны 12. Тем не менее, эта комбинация маркер обнаруживает только подмножество клеток мыши. Другой подход заключается в расширении процессов анализирующие программным обеспечением. Тем не менее, все эти подходы либо не подходят для любого вида экспериментальной установки или для любого субъекта опухоли и метода трансплантации.
В данном исследовании мы представляем новый и быстрый способ всесторонне разрушающих клетки мышей из ксенотрансплантированной тканей вне зависимости от штамма и ткани происхождения мыши. В скринингов на нескольких целевых органов и тканей для трансплантации ксенотрансплантатов (в том числе кожи, легких, головного мозга, почек и скелетных мышц), мы смогли определить комбинацию антител, позволяющих всесторонне обнаруживать клетки мыши. Эти антитела были связаны с суперпарамагнитных частиц, титрование и оптимизированы для разрушения с помощью магнитной сортировки клеток. Как только конкретная мышьантитела используют клетки-мишени человека остаются "нетронутыми" и метод не ограничивается ксенотрансплантированы опухолевой ткани. Показано, что всестороннее удаление клеток мыши из ксенотрансплантированной образцов опухолей стандартизирует и способствует культур опухолевых клеток человека. Кроме того, мы показываем, что анализ ксенотрансплантатов опухолей человека с помощью следующего поколения секвенирования значительно улучшается. Как этот эффект наблюдался, хотя конкретный выбор последовательность человека была проведена во время обогащения ExoME, влияние на весь геном и весь транскриптома последовательности, как ожидается, будет еще более заметным. Взятые вместе, удаление клеток мыши, используя этот новый способ облегчает культивирование опухолевых клеток человека и значительно улучшает вниз по течению анализа ксенотрансплантатов опухолей человека.
Мы разработали быстрый и легкий метод, чтобы изолировать нетронутые опухолевых клеток человека из ксенотрансплантированной опухолевой ткани. Эта процедура основана на комплексном истощению клеток мышиной происхождения путем объединения автоматизированной диссоциации ткани и магнитной сортировки клеток. Помимо истощения всех клеток мыши также количество мертвых клеток и мусора значительно снижается во фракции клеток-мишеней. В совокупности этот метод значительно улучшает молекулярного анализа вниз по течению и культивирование опухолевых клеток человека.
В отличие от альтернативных методов, нет необходимости в знании опухолевых клеток специфических маркеров, корректировка различных композиций клеток мыши или создании алгоритмов. Представленный метод не зависит от мышиного штамма и типа опухоли. Таким образом, смещение путем изоляции опухолевых субпопуляций человека на основе отдельных специфических маркеров человека , которые могут изменяться в выражении, как показано на EpCAM 11, является избегатьредактор Кроме того, оно не ограничивается опухолевого материала, но может быть использован для любого вида ксенотрансплантированы ткани, как клетки мыши целевой вместо конкретных субпопуляций опухолей человека (данные не показаны).
Всестороннее удаление клеток мыши способствует ориентации поверхностных эпитопов экспрессируется исключительно на клетках мышиной происхождения. Помимо хорошо налаженной метод опухолевой диссоциации, как представлено в данном исследовании, существует множество процедур с использованием различных видов ферментов. Сохранение клеточной поверхности эпитопов является предпосылкой для этого нового метода, но и для точного анализа популяций опухолевых клеток человека. Поэтому крайне важно, чтобы пологие ферменты используются для переваривания ткани опухоли. Таким образом, истощение клеток мыши может использоваться только в сочетании с ферментными процедурами с пищеварением, которые, очевидно, не влияют на антигенные детерминанты, ориентированные во время процедуры обеднения мыши клеток. В случае возникновения сомнений это можно проверить только с помощью соответствующего производителя.
<pкласс = "jove_content"> Этот метод также работает для человека циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Тем не менее, поскольку частоты клеток-мишеней, как правило, <0,1% удаление клеток мыши дополнительно требует красной лизис клеток крови и чистотой более чем на 50%, нельзя ожидать. В этом случае, истощение мыши клетка может быть использован в качестве предварительного обогащения ЦОК с последующим обогащением с использованием позитивных маркеров (данные не показаны).Удаление клеток мыши значительно улучшает культуру опухолевых клеток человека, избегая культуры зарастают фибробластов мыши. Кроме того, анализ ксенотрансплантатов опухолей человека с помощью следующего поколения последовательности значительно улучшены и стандартизированы. Как этот эффект наблюдался, хотя выбор целевой человек последовательность конкретных была проведена во время обогащения ExoME, влияние на весь геном и весь транскриптома последовательности, как ожидается, будет еще более заметным.
Кроме того, данный способ облегчает ACCURAТе молекулярные исследования опухолевых субпопуляций в пределах ксенотрансплантированных опухолей человека. Удаление клеток мыши из соответствующего образца на первой стадии , а затем сортировки опухолевых клеток человека в двух различных субпопуляций позволяет осуществлять прямое молекулярное сравнение опухоли субпопуляции интерес к человеческому насыпных опухолевых клеток 20. Дифференциальная экспрессия генов между опухолевых клеток подтипов может быть более надежно оценена, как она не зависит от перекрестной гибридизации мышиных полученных молекул.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |