인간 종양 이종 이식은 생체 혈관의 성장 단계 중 마우스 유래의 세포에 의해 함침된다. 하류 분석시 이러한 세포의 오염에 의한 바이어스를 회피하기 위해, 자기 세포 선별에 의해 모든 마우스 세포의 광범위한 공핍을 허용하는 방법을 개발 하였다.
암 연구를위한 시험 관내 세포주 모델의 사용은 유용한 도구가되어왔다. 그러나, 이러한 모델은 확실히 다른 분석 한 환자에서 종양을 모방하지 못하는 것으로 나타났다. 인간 종양 이종 이식 종양 생물학, 약물 발견 및 전이 연구 2-4에 대한 황금 표준을 나타냅니다. 종양 이종 이식 종양 세포주, 일차 종양 환자 4 직렬 이식 종양에서 종양 조직 같은 재료의 종류로부터 유도 될 수있다. 생체 내에서 전파되는 경우, 이종 이식 조직 침윤 및 마우스 유래의 세포에서 혈관된다. 이러한 종양 엔티티 여러 요인 이종 이식 이식 물질, 성장 속도 영역의 원점은 조성물 종양 이종 이식 마우스에 존재하는 세포의 양에 영향을 미친다. 그러나, 이러한 요소가 일정하게 유지되는 경우에도, 마우스 세포 오염의 정도가 매우 다양하다.
공동ntaminating 마우스 세포는 상당히 인간 종양 이종 이식의 하류의 분석을 방해. 마우스 섬유 아세포는 높은 도금 효능 증식 속도 표시, 그들은 특히 천천히 개체군 증식 인간 종양 세포의 배양 자라다하는 경향이있다. 마우스 세포 DNA, mRNA를 산출하고 단백질 성분을 바이어스 할 수 하류 유전자 발현 분석, 차세대 시퀀싱뿐만 아니라, 프로테옴 분석 (5). 이러한 한계를 극복하기 위해, 이종 이식 종양 조직에서 본래 인간 종양 세포를 분리하는 빠르고 쉬운 방법을 개발 하였다. 이 절차는 벤치 탑 조직 dissociator 자기 세포 선별에 자동화 된 조직의 분리를 조합하여 마우스 유래의 세포의 광범위한 공 핍층에 기초한다. 여기서는 인간 표적 세포가 종양 유형에 독립적 미만에서 20 분 이내에 순도 96 % 이상을 얻을 수있을 수 있다는 것을 보여준다.
고체 인간의 종양은 여러 생리 학적뿐만 아니라 종양 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 그들은 복잡한 생물학적 구조와 이종 조직을 형성한다. 생물 종양 형성, 진행 등의 프로세스 및 치료를 향한 반응은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 체외 세포 배양 모델을 연구하고 종양 생물학을 이해하는 유용한 도구를 나타냅니다. 그러나, 이들은 부분적으로 종양 조직에서 발견되는 구조와 과정을 반영 할 수있다. 신뢰성 있고 안정적인 전임상 인간 종양 모델은 항암 약물 요법과 4,6의 개발뿐만 아니라 종양 생물학 및 종양 세포와 주변 환경의 상호 작용을 이해하기위한 전제 조건이다.
주 환자의 종양에서 파생 된 인간 종양 이종 이식 모델은 약 7 마이크로 환경 구조, 전이 가능성 및 응답 높은 조직 학적 구조에 대한 기원의 조직 관계, 상호 작용을 보여 </sup>. 종양 이종 이식에 따라서 시험 관내 세포 배양 모델에 비해 가장 높은 유효성 분석을 도시 배양 된 세포 또는 세포주들은 더 가깝게 모방 환자 종양으로부터 유도되는 경우에도. 이러한 기능은 그들 전임상 모델 4의 황금 표준합니다. 암 연구에서의 응용 이외에 마우스에 인간 세포의 이종 이식은 종종 타겟 인구 8 stemness 분화 잠재력을 결정하는 줄기 세포 연구에 사용된다.
그것은 인간의 미세 혈관을 보였다과 인간의 면역 세포는 인간의 종양 2,9의 생체 내 전달에 대체됩니다. 이러한 이식 종양 아형, 성장 속도, 및 지역과 같은 요인 주요 침입 세계적 수준에 대한 영향뿐만 아니라 발견 마우스 세포 유형의 조성물을 갖는다. 그러나, 이러한 요인이 일정하게 유지되는 경우에도, 양, 마우스 세포의 조성물은 매우 가변적.
이종 이식 조직의 다운 스트림 분석은 종종 쥐 기원의 세포에 의해 도전을하고 있습니다. 이종 이식에서 인간 종양 세포의 차 문화는 자주 섬유 아 세포에 의해 자란있다. 시험관 내에서 종양 세포주의 생성을 방해 외에, 이러한 약물 독성 시험 또는 약동학 등 하류 분석 마우스 세포를 오염시키는 것은 대부분의 경우에 불가능 유래 효과 실리 정정 이후에 바이어스된다. 그건 그렇고, 마우스 섬유 아세포와 인간 종양 세포 사이의 유일한 부분적으로 밝혀 크로스 토크는 연구 (10)의 실험 결과에 직접적인 영향을 미친다. 또한, 마우스 세포 침윤 가장 널리 예측할 변동 정확한 분자 하류 분석을 악화시킨다. NGS 또는 프로테옴에서 직접 시퀀싱 감도를 감소 인간 종양 신호 대신에 측정 된 각각의 마우스에서 파생 된 신호를 분석한다. 또한 마이크로 어레이 기반의 발현 분석은 쥐 NUC에 의해 도전leic 산 인간의 프로브에 가능한 크로스 혼성화.
다른 접근 방법이 제안되어있다 이종 이식 모델에서 인체 종양 세포의 전방 분석 마우스 세포 오염의 장애물을 회피하기 위해. 많은 연구에서 하류 분석 원하는 타겟 셀은 배타적 인간 종양 세포에 발현 마커 또는 마커의 조합을 이용하여 분리된다. 그러나, 인간 종양 세포의 양의 식별에 대한 신뢰성있는 마커의 부족은 종종 큰 장애물을 나타낸다. 인간 암종에는 EpCAM으로도 광범위하게 표현 마커, 자주 종양 고유의 표현의 차이 (11)을 보여줍니다. 이것은 낮은 발현 개체군은, 예를 들면, 종양 세포가 분리 과정 상피 간 간엽 전환 후의 손실 위험을 증가시킨다. 또한, 상기 타겟 셀에 선택 화제의 직접 결합은 후속 분석 결과에 영향을 미칠 수있다. 마우스에 의해 세포를 파괴의 시도쥐 CD45 및 MHC 클래스 I 항원에 특이적인 항체의 조합을 사용하는 것은도 12를 제조 하였다. 그러나, 이러한 마커 조합은 마우스 세포의 서브 세트를 검출한다. 또 다른 방법은 소프트웨어에 의해 분석하는 방법을 개선하는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법 중 하나를 실험 장치의 종류 또는 종양 엔티티 및 이식 방법에 적합하지 않습니다.
이 연구에서 우리는 포괄적으로 마우스 변형 및 기원 조직의 독립적 인 이종 이식 조직으로부터 마우스 세포를 파괴하기위한 새롭고 빠른 방법을 제시한다. (피부, 폐, 뇌, 신장, 골격근 포함) 이종 이식 여러 표적 기관 및 조직의 검사에서는 포괄적 마우스 세포 검출을 허용하는 항체의 조합을 식별 할 수 있었다. 이들 항체는 상자성 입자에 결합 적정 자기 세포 분류를 사용하여 붕괴에 대해 최적화되었다. 으로 만 마우스 특정인간 항체는 표적 세포가 "그대로"유지, 사용되는 상기 방법은 xenotransplanted 종양 조직에 한정되지 않는다. 이종 이식 종양 샘플은 표준화 및 인간 종양 세포의 배양을 용이에서 우리는 포괄적으로 제거 마우스 세포를 보여준다. 더욱이, 우리는 차세대 염기 서열 인간 종양 이종 이식의 분석은 현저하게 개선되는 것을 보여준다. 인간 서열의 특정 선택은 엑솜 농축 동안 수행 하였지만,이 효과는 관찰 된 바와 같이, 전체 게놈 시퀀싱 전 사체에의 영향은 더욱 눈에 띄는 것으로 예상된다. 종합적으로, 이러한 신규 방법을 사용하여 마우스 세포를 제거하여, 인간 종양 세포의 배양을 용이하게 크게 인간 종양 이종 이식의 하류 분석을 개선한다.
우리는 이종 이식 종양 조직에서 본래 인간 종양 세포를 분리하는 빠르고 쉬운 방법을 개발 하였다. 이 절차는 자동화 조직 해리 자기 세포 분류를 조합하여 마우스 유래의 세포의 광범위한 공 핍층에 기초한다. 모든 마우스 세포와 죽은 세포 파편의 양을 크게 공핍 외에 표적 세포 분획에서 감소된다. 함께 찍은,이 방법은 크게 분자 다운 스트림 분석과 인간 종양 세포의 배양을 향상시킨다.
다른 방법과는 대조적으로, 특정 종양 세포 마커, 마우스 세포 또는 알고리즘의 확립의 조성 변화로 조절 기술에 대한 필요가 없다. 제시된 방법은 마우스 균주 및 종양 유형에 독립적이다. 따라서,는 EpCAM (11)과 같이 표현 다를 수 인간 단일 특정 마커에 기초하여 인간 종양 개체군의 분리를 통해 바이어스 피하기는에디션. 또한,이 종양의 재료에 한정되지 않고, 마우스 세포 대신 특정 인간 종양 개체군의 타겟팅 된 바와 xenotransplanted 조직의 종류에 사용할 수있는 (데이터는 보이지 않음).
마우스 세포의 광범위한 제거가 독점적 마우스 유래의 세포 표면에 발현 된 항원을 표적으로 용이하게된다. 이 외에도 연구에서 제시된 종양 해리의 잘 확립 된 방법에서, 효소의 다른 종류를 사용하여 많은 절차가 있습니다. 세포 표면 에피토프의 보존이 신규 한 방법뿐만 아니라, 인간 종양 세포 집단에 대한 정확한 분석을위한 전제 조건이다. 따라서, 부드러운 효소 종양 조직의 분해에 사용되는 것이 중요하다. 따라서, 마우스 세포 고갈는 분명히 마우스 세포 고갈 절차 중에 표적 에피토프에 영향을 미치지 않는 효소 분해 방법과 조합하여 사용할 수있다. 의심스러운 경우에만 각각의 제조업체에 의해 검증 될 수있다.
<p클래스 = "jove_content은">이 방법은 인간의 순환 종양 세포 (CTCS) 작동합니다. 그러나, 표적 세포의 빈도가 일반적이기 때문에 <마우스 세포의 0.1 % 탈 추가적으로 기대할 수없고 적혈구 용해하고 50 % 이상의 순도를 필요로한다. 이 경우, 마우스 세포 고갈은 포지티브 마커를 사용하여 농축 하였다 CTCS 사전 농축로서 사용될 수있다 (데이터는 보이지 않음).마우스 세포를 제거하여 현저 마우스 섬유 아세포의 배양 자라다 회피하여 인간 종양 세포의 배양을 향상시킨다. 또한, 차세대 시퀀싱에 의한 인간 종양 이종 이식의 분석은 상당히 향상되고 표준화된다. 타겟 인간 서열 특정 선택은 엑솜 농축 동안 수행 하였지만,이 효과는 관찰 된 바와 같이, 전체 게놈 시퀀싱 전 사체에의 영향은 더욱 눈에 띄는 것으로 예상된다.
또한, 상기 제시된 방법은 ACCURA 용이xenotransplanted 인간의 종양에서 종양 개체군의 테 분자 연구. 두 개의 다른 개체군에서는 인간 종양 세포를 선별 제 1 단계에서 각각의 시료로부터 마우스 세포의 분리 및이어서 벌크 인간 종양 세포 (20)가 관심 종양 모집단 직접 분자량 비교를 가능하게한다. 이 마우스 유래의 분자의 교차 혼성화에 영향되지 않는 종양 세포 아형 사이의 차등 유전자 발현을보다 확실하게 평가할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |