ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

全ての動物実験はRegierungspräsidiumフライブルクReferat 35の地域の倫理と法律上のガイドラインに従って行われました。 1.試薬の調製注：この実験を開始する前に、解離キットから以下の試薬を準備します。 酵素Hを調製するためには、RPMI1640ロズウェルパーク記念研究所1640（RPMI1640培地）またはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）3mlに凍結乾燥粉末の各バイアルを溶かします。 6ヶ月まで、20℃ -適切なアリコート（ 例えば 、200μl）を準備し凍結融解の繰り返しを避け、でそれらを格納するために。 酵素Rを調製するためには、RPMIまたはDMEM培地2.7 ml中に凍結乾燥粉末のバイアルを溶解します。 6ヶ月まで、20℃ -適切なアリコート（ 例えば、100μl）を準備し凍結融解の繰り返しを避け、でそれらを格納するために。 Vを溶解酵素Aを調製するために緩衝液A 1ml中の凍結乾燥粉末のIALはボルテックスなしキットに付属しました。適切なアリコート（ 例えば 、25μl）を準備し凍結融解の繰り返しを避け、でそれらを格納するために- 20°Cは、最大6ヶ月間。徹底的に必要な反応容積を引き抜く直前にこの懸濁液を混合することを確認します。 細胞分離手順および抗体染色のために250ミリリットルのバッファ（1×PBS、0.5％BSAを含む）を準備します。 注：マウス細胞を除去した後の培養細胞は、0.22μmのフィルターを通して、すべてのバッファおよび酵素溶液をフィルタリングします。 2.腫瘍解離プロトコル注：この研究では、非小細胞肺癌（NSCLC）、腎臓癌および膀胱の患者由来の異種移植片を用いました。先に説明したように13 6週齢の雌NMRIのnu / nuマウス-腫瘍を4に、非小細胞肺癌（NSCLC）、腎臓癌、および膀胱の異種移植片を移植することによって生成されました</s>アップ。 注意：このプロトコルは、腫瘍型の完全に独立しているように、それは、プロトコルを変更することなく、患者または細胞株由来の腫瘍ならびにヒト異種移植組織の他のタイプの任意の種類のために使用することができます。 （新たな細胞解離チューブにRPMI 1640またはDMEMの4.7ミリリットル、酵素H200μlの、酵素R100μlの、および酵素Aを25μlを添加することにより、（1グラムまで）組織サンプルあたりの消化ミックスの5ミリリットルを準備Cチューブ）。徹底的に必要なボリュームを引き出す前に、酵素Rサスペンションを混合することを確認します。 麻酔下で頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。 80％（v / v）のエタノールの少量を噴霧することにより、マウスを消毒します。 組織培養フードに鉗子とハサミを用いてマウスの側腹部から皮下腫瘍を収穫。ハサミを用いて腫瘍の代わりに開いた皮膚をカットした後、ピンセットやハサミを使用して、隣接する健康な組織から腫瘍を分離します。 注：の目的の応じて実験は、無菌条件下でこれと次の手順を実行します。この研究では、全てのステップは、細胞を培養することができることにために無菌条件下で細胞培養フード内で行いました。 ピンセットやメスを使用してそれを離れて切断することにより（これは減少した生存能力になりますように）と壊死領域（これはサンプルのフロートを作るように）脂肪を除去することにより、消化のために腫瘍サンプルを準備します。メスや鉗子を使用して、4ミリメートル – 2の片に組織をミンチ。 消化混合物を含むCチューブに組織片を転送します。 Cチューブを閉じて、それがしっかりと閉じていることを確認してください。卓上組織解離のスリーブ上に逆さまにそれを取り付け、組織片は、ロータ/ステータのエリアに位置していることを確認してください。 モードが表示され、その後、「開始」ボタンを押すまで、「上」または「下」ボタンを押してモード」h_tumor_01 "を選択します。 もしあなたが卓上組織解離の加熱機能を歌い、また、ヒーターを取り付けてください。そして、フォルダ「ミルテニー」が表示されるまでタッチスクリーン上のフォルダシンボルをクリックすることで、モード37C_h_TDK_1（ソフト腫瘍用）、37C_h_TDK_2（中の腫瘍の場合）または37C_h_TDK_3を（ハード腫瘍のため）を実行します。 モードを選択するには、37C_h_TDK_2が強調表示される解離モードまで上または下の矢印をクリックします。卓上組織解離のスリーブは、デバイスのディスプレイ上の位置として示されています。サンプルは、タッチスクリーン上でそれらをクリックすることにより、上で実行されている位置を選択してください。押してモードを実行し、ステップ2.16を続行するには「開始」。 注：別の解離プログラムが適切であるかもしれない腫瘍の種類に応じて（ステップ2.7.1を参照してください）​​。 画面上の「プログラムの終了」を示すウィンドウを観察します。プログラムの終了後、ベンチトップ型組織解離からCチューブを外します。 37で30分間サンプルをインキュベートチューブローテーターを用いて、 例えば連続的な回転下でCが°。 インキュベーション後卓上組織解離のスリーブの上に逆さまにCチューブを取り付けます。再度、サンプル材料は、ロータ/ステータのエリアに位置していることを確認してください。 ステップ2.7.1で説明したように解離プログラム（ソフトとミディアムの腫瘍用）h_tumor_02または（ハード腫瘍用）h_tumor_01を実行します。 プログラムの終了後、ベンチトップ型組織解離からCチューブを外します。 連続回転下、37℃で30分間サンプルをインキュベートします。 インキュベーション後の卓上組織解離のスリーブの上に逆さまにCチューブを取り付けます。再度、サンプル材料は、ロータ/ステータのエリアに位置していることを確認してください。 ステップ2.7で説明したように（ハード腫瘍の）解離プログラム（中腫瘍用）（ソフト腫瘍について）h_tumor_03、h_tumor_02またはh_tumor_01を実行します。 チューブの底にサンプル材料を収集するには、笙を行います（10秒間100×gで）室温遠心分離工程。 細胞を再懸濁し、50 mlチューブ上に配置された70μmの寒さに敏感なサイズのセルストレーナーに適用されます。 RPMI 1640またはDMEM 20mlでセルストレーナーを洗浄します。 7分間300×gで遠心し細胞懸濁液。完全に上清を吸引。 カウント用の緩衝液5mlで細胞を再懸濁し。磁気細胞分離（セクション3）によるマウス細胞枯渇を続行します。 磁気細胞分離技術によって3.マウス細胞枯渇注：下記の磁気標識のためのボリュームは最大2×10 6個の腫瘍細胞や赤血球を含む10 7全細胞のためのものです。腫瘍の大きさに応じてより低いまたはより高い細胞数が得られます。示されるように、少数の細胞の場合、同じボリュームを使用します。高い細胞数を使用する場合は、4×10 6腫瘍細胞又は2×10応じてすべての試薬 ​​ボリュームと総体積（ 例えば、スケールアップ<suP> 7全細胞は、すべての示された試薬容量と総容量）の2倍量を使用します。 カウント用の顕微鏡および適切なチャンバーを用いて、ステップ2.21での細胞懸濁液からのアリコートの細胞数を決定します。 注：この時点で、細胞懸濁液は、赤血球を含むヒト腫瘍細胞ならびにマウス間質および血液細胞の不均一混合物からなります。細胞の組成物は、強く移植のための腫瘍の種類や地域によって異なります。 マウス細胞を除去した後、フローサイトメトリー分析を行う際に、フローサイトメトリー分析のために染色されていない二つの単色コントロール染色のために適当なチューブに100μlのアリコートを引き出します。さらに染色工程（セクション4）まで8℃ – 2で冷蔵庫に保管してください。 10分間、300×gで遠心し細胞懸濁液。上清を捨てます。 2×10 6個の腫瘍細胞または10 7あたりバッファ80μlの再懸濁細胞ペレット全細胞は、マウス細胞の磁気標識試薬20μlのを追加します。 よく混ぜ、冷蔵庫で15分間インキュベートする（2から8℃）。磁気標識の間に、適切な磁石の磁場に置くことで、磁気分離のための大規模なカラム（LSカラム）を調製製造業者のプロトコルに従って（材料および機器の表を参照してください）​​。バッファーの3ミリリットルでカラムを洗浄します。 最大2×10 6個の腫瘍細胞または最大10 7全細胞のためのバッファを使用して500μlにサンプル音量を調整します。 （7腫瘍細胞または最大5×10、1×10までの合計7細胞は、より多くの細胞での作業は、複数のLSカラムにサンプルを分割するとき。1 LSカラム上で処理することができます）。 フローサイトメトリー解析、分子解析を行うか、培養物中の画分を比較すると、ソートされていない試料と50μlのアリコートを引き出します。さらに処理するまで8℃ – 2で冷蔵庫に保管してください。 </李> 先に調製したカラムに細胞懸濁液を500μlを適用します。濃縮されたヒト腫瘍細胞を表し、非標識標的細胞を含有するフロースルーを集めます。 注：3.5つの列に適用することができるステップに従って調製した細胞懸濁液2.5 mlまでのより高い細胞数を扱います。 バッファの2×1mlでカラムを洗浄。通過した細胞を収集し、ステップ3.6からのフロースルーと組み合わせます。すぐに列リザーバが空になるように1ミリリットルのバッファのアリコートを添加することにより、洗浄工程を実行します。 注：フロースルーは、精製されたヒト腫瘍細胞が含まれています。 また、カラムに保持マウス細胞を収集するには、分離器から列を削除し、適切なチューブの上に置きます。ピペットバッファーの3ミリリットルカラムに、すぐにはしっかりと列にそれを押してマウス細胞を洗い流すためにプランジャーを使用しています。 10分間、300×gでの分画およびコントロールサンプルをスピンダウン。吸引しsupe希望の下流の用途に応じて、完全にrnatantおよび緩衝液、培養培地中に再懸濁細胞または液体窒素中でペレットを凍結します。 4.ダウンストリーム分析 フローサイトメトリー分析のために染色 メモがさらなる下流の分析を行う前に、マウス細胞の枯渇手順から得られた細胞の一部を解析することができるフローサイトメトリー（ 例えば 、純度および収率を評価します）。 フローサイトメトリーのために、10分間、300×gでステップ3.2および3.5からの負と正の磁気細胞分離手順（セクション3）から得られた画分と同様に対照サンプルのスピン少なくとも10％を分析します。 上清を捨てます。バッファの90μlのステップ3.2から染色対照試料の細胞ペレットを再懸濁します。バッファー80μlの磁気細胞分離手順から得られた画分を再懸濁します。 すべてにマウスのFcRブロッキング試薬10μlのを追加サンプル。よく混ぜると2で5分間インキュベート – 冷蔵庫で8℃。 （1の抗体希釈に等しい：4）（1:10の抗体希釈に等しい）、抗ヒトEpCAMを-PEの10μlを添加して、抗マウスAPCカクテルの25μlのサンプルに部3からの抗10μlのを追加します。 – ヒトのEpCAM-PE 1単色コントロールサンプル（1:10の抗体希釈に等しい）と抗ヒトEpCAMを-APC10μlのに他に（1:10の抗体希釈に等しいです）。すべてのサンプルを混合し、2で10分間インキュベート – 冷蔵庫で8℃。 注：EpCAMの任意の腫瘍型の腫瘍細胞マーカーとして適していません。この研究のEpCAM発現に使用される腫瘍のために知られていました。 サンプルを洗浄するために、5分間、300×gで各スピンをバッファの1ミリリットルを追加します。 上清を捨て、フローサイトメトリー分析のための濃度に細胞ペレットを再懸濁します。死細胞を排除するには、ヨウ化プロピジウム（1μg/ ml）を追加します。 適切なFを用いたフローサイトメトリー分析を実行製造業者のプロトコルに従ってローサイトメーター。 ヒト腫瘍細胞の培養 注：フローサイトメトリーに加えて、分離操作から得られた細胞を培養することができ、in vitroでのさらなるアッセイのために用いられます。 5×10 5細胞/ mlの濃度になるように培地中の部3からソート画分を再懸濁します。 注：腫瘍タイプのコーティングに応じて、適切な播種密度、および培養条件は異なり得ます。 0.1％ゼラチンでコーティングした24ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液の500μlのを追加します。 37℃、5％の細胞培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 注：最適な培養条件を用いた腫瘍の種類によって異なります。従って、使用される腫瘍の種類に適した培養条件を適用します。 培養細胞の免疫蛍光染色 10％FCSおよび0.1％を添加することによりブロッキング溶液を調製トリトンX-100 PBSを1倍にします。 廃棄培地。細胞を洗浄し、ウェル当たり1×500μlのPBSを追加します。完全に1×PBSを捨てた後、室温（RT）で2分間インキュベートします。 4％PFA溶液を300μlを加えることによって、細胞を固定。室温で15分間インキュベートします。 PFA液を捨てます。ステップ4.3.2に示すように固定された細胞を3回洗浄します。 ウェルあたりブロッキングを300μlを添加することにより、透過処理し、ブロッキングを実行します。室温で30分間インキュベートします。 ブロッキング溶液を廃棄します。ステップ4.3.2に示すように細胞を洗浄します。 細胞へのブロッキング溶液中に希釈した一次抗体を300μlを追加します。 200：のEpCAM抗体は、1：40希釈した抗ヒト、ビメンチン抗体を1に希釈します。 8°C – 2で一晩インキュベートします。 注：のEpCAM、腫瘍細胞上に発現されないことがあり、及び/又はビメンチンは、腫瘍細胞によって発現されるように使用される抗体は、任意の腫瘍型には適していません。使用した抗体は、異種移植カ月に適していることを確認しますデル。 一次抗体溶液を廃棄してください。ステップ4.3.2に示されているように、細胞を3回洗浄します。 細胞へのブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を300μlを追加します。 400：両抗体、抗ウサギIgG-Alexe594及び抗マウスIgG-Alexa488標識が1に希釈します。室温で暗所で1時間インキュベートします。 二次抗体溶液を廃棄してください。ステップ4.3.2に示されるように、細胞を2回洗浄します。 各ウェルにDAPI溶液を300μlの（0.1μgの/ ml）を追加します。室温で暗所で10分間インキュベートします。 DAPI液を捨てます。ステップ4.3.2に示されているように、細胞を3回洗浄します。 各ウェルに1×PBS500μlのを追加します。適切な顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡を実行します。 全体Exomeシーケンシング 全体exomeシーケンシング（WES）のために液体窒素中でステップ3.9からペレットを凍結します。ストアとは、-80℃でサンプルを収集します。 細胞を回収した後、exomeキャプチャ全体exomeの配列を実行しますそれぞれのキットのメーカーの指示に従ったuencing（材料および機器の表を参照してください）​​。