JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

Published: July 29, 2016
doi:
10.3791/54259
, , , , , , , ,
1R&D Reagents,Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology,Oncotest GmbH

概要

Humane tumor xenotransplantaten zijn gevasculariseerd en geïnfiltreerd door cellen van muizen oorsprong tijdens de groeifase in vivo. Om de voorspanning door deze contaminerende cellen tijdens downstream analyse te omzeilen, hebben wij een methode waardoor uitgebreide depletie van muizencellen door magnetische celsortering.

Abstract

Het gebruik van in vitro cellijn modellen voor kankeronderzoek is een nuttig instrument geweest. Er is echter aangetoond dat deze modellen niet betrouwbaar te bootsen patiënt tumoren in verschillende assays 1. Geënte, humane tumoren vertegenwoordigen de gouden standaard met betrekking tot de tumor biologie, drug discovery, en metastase onderzoek 2-4. Tumor xenotransplantaten kunnen worden afgeleid uit verschillende materialen zoals tumorcellijnen tumorweefsel van de patiënt primaire tumoren 4 of serieel getransplanteerde tumoren. Wanneer gekweekt in vivo, is xenogetransplanteerde weefsel geïnfiltreerd en gevasculariseerd door cellen van muizen oorsprong. Meerdere factoren zoals tumor entiteit, de oorsprong van xenotransplantatie materiaal, groeisnelheid en regio transplantatie invloed op de samenstelling en de hoeveelheid muizencellen aanwezig in tumoren xenotransplantaten. Zelfs wanneer deze factoren constant worden gehouden, de mate van verontreiniging muizencel is zeer variabel.

Contaminating muizencellen aanzienlijk beperken stroomafwaarts analyses van geënte, humane tumoren. Een muis fibroblasten vertonen een hoge plating Effectiviteit en proliferatie tarieven, hebben ze de neiging om culturen van menselijke tumorcellen overwoekeren, in het bijzonder langzaam prolifererende subpopulaties. Muizencellijnen afgeleide DNA, mRNA en eiwit componenten voorspanning stroomafwaarts genexpressie-analyse, de volgende generatie sequencing, en proteoomanalyse 5. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we gemakkelijk methode ongerepte humane tumorcellen uit xenogetransplanteerde tumorweefsel isoleren ontwikkeld. Deze procedure is gebaseerd op de uitgebreide depletie van cellen van muizen oorsprong combineert geautomatiseerde weefsel dissociatie met de stationaire weefsel dissociator en magnetische celsortering. Hier tonen we aan dat menselijke doelcellen kan worden kan in minder dan 20 min afhankelijk van het tumortype verkrijgbaar zuiverheid hoger dan 96%.

Introduction

Vaste humane tumoren uit verschillende fysiologische en neoplastische celtypen. Zij vormen heterogene weefsels met complexe biologische structuren. Biologische processen zoals tumorvorming, progressie en de reacties in de richting van therapieën zijn nog niet volledig begrepen. In vitro celcultuur modellen vertegenwoordigen een nuttig instrument om te studeren en te begrijpen tumor biologie. Ze kunnen echter slechts gedeeltelijk spiegel structuren en processen in tumorweefsels. Betrouwbaar en stabiel preklinische humane tumormodellen zijn een vereiste voor de ontwikkeling van anti-tumor geneesmiddelen en therapieën 4,6 en voor het begrijpen tumor biologie en de interactie van tumorcellen en hun omgeving.

Human tumor xenograft modellen afgeleid van primaire patiënt tumoren hoog relaties aan het weefsel van herkomst met betrekking tot histologische architectuur, interacties met micro-ecologische structuren, metastatische potentieel en de reacties op drugs 7 </sup>. Zelfs als tumor xenotransplantaten zijn afgeleid uit gekweekte cellen of cellijnen deze beter nabootsen patiënt tumoren daarom geeft hogere geldigheid meeste assays vergeleken met in vitro celcultuur modellen. Deze eigenschappen maken ze de gouden standaard van preklinische modellen 4. Naast de toepassing ervan in het onderzoek naar kanker, is xenotransplantatie van menselijke cellen in muizen ook vaak gebruikt in stamcelonderzoek aan de stemness en differentiatie potentieel van een doelgroep 8 bepalen.

Er is aangetoond dat menselijke microvasculatuur en menselijke immune cellen vervangen bij in vivo propagatie van humane tumoren 2,9. Factoren zoals de tumor subtype, groei, en de regio van de transplantatie hebben grote invloed op het mondiale niveau van infiltratie en de samenstelling van het type muis cel gevonden. Zelfs wanneer deze factoren constant worden gehouden, de hoeveelheid en de samenstelling van muizencellen zijn zeer variabel.

Stroomafwaarts analyses van xenotransplantatie weefsels vaak uitgedaagd door cellen van muizenoorsprong. Primaire kweken van menselijke tumorcellen uit xenotransplantaten worden vaak overwoekerd door fibroblasten. Daarnaast belemmert de vorming van tumorcellijnen in vitro, stroomafwaarts assays zoals drugs cytotoxiciteit testen of farmacokinetiek vertekenen doordat in silico gecorrigeerd voor effecten afkomstig van contaminerende muizencellen onmogelijk is in de meeste gevallen. Buiten dat, het slechts gedeeltelijk opgehelderd overspraak tussen fibroblasten van muizen en menselijke tumorcellen heeft een directe impact op de experimentele resultaten van de studies 10. Bovendien is de meest onvoorspelbare variatie van infiltrerende muizencellen verergert nauwkeurige moleculaire stroomafwaarts analyses. In NGS of proteoom analyseert elke muis afgeleid signaal gemeten in plaats van een mens tumor signaal direct afneemt sequencing gevoeligheid. Ook microarray gebaseerde expressie analyses worden uitgedaagd door muizen nucleic zuren eventueel kruis hybridiseert menselijke probes.

Teneinde de belemmeringen van verontreinigende muizencellen stroomafwaarts analyses van humane tumorcellen uit xenograft modellen verschillende benaderingen zijn voorgesteld omzeilen. In veel studies gewenste doelwitcellen voor downstream analyse worden geïsoleerd door gebruik markers of combinaties van merkers die uitsluitend tot expressie gebracht op humane tumorcellen. Echter, het gebrek aan betrouwbare merkers voor positieve identificatie van humane tumorcellen vormt vaak een grote hindernis. Zelfs algemeen uitgedrukt markers, zoals EpCAM menselijke carcinomen, vertonen vaak tumor intrinsieke expressieverschillen 11. Dit verhoogt het risico groter dat expressie subpopulaties, bijvoorbeeld tumorcellen ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie, verloren tijdens isolatie. Bovendien, de directe binding van een selectiemiddel voor de doelcel kunnen beïnvloeden de volgende analyseresultaten. Pogingen van uitputting muizencellen dooreen combinatie van antilichamen die specifiek zijn voor murine CD45 en MHC klasse I epitopen zijn ook gemaakt 12. Echter, deze markering combinatie detecteert slechts een subset van muizencellen. Een andere benadering is het analyseren processen verbeteren door software. Toch al deze benaderingen zijn ofwel niet geschikt voor elke vorm van experimentele opstelling of voor een tumor entiteit en transplantatie methode.

In deze studie presenteren we een nieuwe en snelle methode voor het volledig afbreken muizencellen van xenotransplantatie weefsels onafhankelijk van de muizenstam en weefsel van oorsprong. In screenings op meerdere doelwit organen en weefsels voor transplantatie van xenotransplantaten (waaronder huid, longen, hersenen, nier en skeletspier) waren we in staat om een ​​combinatie van antilichamen waardoor volledig detecteren muizencellen identificeren. Deze antilichamen werden gekoppeld aan superparamagnetische deeltjes, getitreerd en geoptimaliseerd voor depletie met behulp van magnetische celsortering. Aangezien alleen muisspecifiekantilichamen gebruikt, humane doelwitcellen verblijven "onaangetast" en de werkwijze is niet beperkt tot xenogetransplanteerd tumorweefsel. We laten zien dat volledig verwijderen van muizencellen van xenogetransplanteerde tumormonsters standaardiseert en vergemakkelijkt, humane tumorcellen. Verder laten we zien dat de analyse van humane tumor xenotransplantaten door next generation sequencing aanzienlijk verbeterd. Aangezien dit effect werd waargenomen, alhoewel een menselijke sequentie specifieke selectie tijdens exome verrijking is uitgevoerd, worden de invloed op het hele genoom en hele transcriptoom sequencing zal naar verwachting nog meer prominente zijn. Bij elkaar genomen, het verwijderen van de muis cellen met behulp van deze nieuwe methode maakt het kweken van menselijke tumorcellen en een aanzienlijke verbetering van de downstream-analyses van geënte, humane tumoren.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische en wettelijke richtlijnen van Regierungspräsidium Freiburg Referat 35. 1. reagens Voorbereiding OPMERKING: Voordat u begint met het experiment, de voorbereiding van de volgende reagentia uit de dissociatie kit: Ter voorbereiding enzym H lossen elk flesje van het gelyofiliseerde poeder in 3 ml RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) of Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM). Om te voorkomen herhaaldelijk bevriezen en ontdooien bereiden geschikte hoeveelheden (bijvoorbeeld 200 ui) en opgeslagen bij – 20 ° C tot 6 maanden. Ter voorbereiding enzym R ontbinding van de flacon met het gevriesdroogde poeder in 2,7 ml RPMI of DMEM medium. Om te voorkomen herhaaldelijk bevriezen en ontdooien bereiden geschikte hoeveelheden (bijvoorbeeld 100 ui) en opgeslagen bij – 20 ° C tot 6 maanden. Om enzym A te bereiden tot ontbinding van de vial van het gelyofiliseerde poeder in 1 ml buffer A geleverd met de kit, zonder vortexen. Om te voorkomen herhaaldelijk bevriezen en ontdooien bereiden geschikte aliquots en bewaar ze op (bijvoorbeeld 25 pi.) – 20 ° C tot 6 maanden. Zorg ervoor dat deze schorsing onmiddellijk grondig te mengen voordat de vereiste reactie volume te trekken. Bereid 250 ml buffer (1x PBS met 0,5% BSA) voor celscheiding procedure en antilichaamkleuring. OPMERKING: Wanneer het kweken van de cellen na verwijdering van muizencellen filteren op alle buffers en enzymen oplossingen door een 0,22 pm filter. 2. Tumor Dissociatie Protocol Opmerking: In dit onderzoek patiënt afgeleide xenotransplantaten van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC), nierkanker en blaas gebruikt. De tumoren werden gegenereerd door het implanteren van xenotransplantaten van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) nierkanker en blaas in 4-6 weken oude vrouwelijke NMRI nu / nu-muizen zoals eerder beschreven 13 </sup>. OPMERKING: dit protocol is volledig onafhankelijk van het type tumor, kan het worden gebruikt voor elk soort patiënt of cellijn afgeleide tumoren en andere humane xenogetransplanteerd weefsel zonder wijziging van het protocol. Bereid 5 ml digestie mix per weefselmonster (tot 1 g) pas door toevoeging van 4,7 ml RPMI 1640 of DMEM, 200 gl enzym H, 100 gl enzym R en 25 ul enzym A in een cellulair dissociatie buis ( C Tube). Zorg ervoor dat u grondig te mengen enzym R schorsing voordat het gewenste volume in te trekken. Offer de dieren door cervicale dislocatie onder narcose. Desinfecteren muis door besproeiing met een kleine hoeveelheid 80% v / v ethanol. Harvest onderhuidse tumor van de muis flank met behulp van pincet en een schaar in een weefselkweek kap. Snijd de huid open plaats van de tumor met een schaar en vervolgens scheiden de tumor van aangrenzende gezonde weefsel met behulp van een tang en schaar. OPMERKING: Afhankelijk van het doel vanhet experiment uitvoeren van deze en volgende stappen onder aseptische omstandigheden. In dit onderzoek alle stappen uitgevoerd in een celkweek kap onder aseptische omstandigheden te zijn uitgevoerd op de mogelijkheid om de cellen te kweken. Bereid de tumor monster voor digestie door het verwijderen van vet en necrotische gebieden (zoals dit het monster float uitkomen) (omdat dit zal leiden tot verminderde levensvatbaarheid) van het weg te snijden behulp van een tang en een scalpel. Gehakt het weefsel in stukken van 2-4 mm met mes en pincet. Breng de stukken weefsel in de C buis met de vertering mix. Sluit de C Tube en zorg ervoor dat het is goed gesloten. Bevestig het ondersteboven op de mouw van het stationaire weefsel dissociator en zorg ervoor dat het weefsel stukken bevinden zich in het gebied van de rotor / stator. Kies de modus "h_tumor_01" door de "up" op of te drukken "down" tot de modus op het display verschijnt en vervolgens op de knop "start". Als jezingen het verwarmen functie van de stationaire weefsel dissociator, zorg ervoor dat ook de verwarming aan te sluiten. Dan lopen mode 37C_h_TDK_1 (voor zachte tumoren), 37C_h_TDK_2 (voor middelgrote tumoren) of 37C_h_TDK_3 (voor harde tumoren) door te klikken op de map symbool op het touchscreen tot de map "Miltenyi" verschijnt. Om de modus te kiezen, klikt u op de pijl omhoog of omlaag totdat de dissociatie modus 37C_h_TDK_2 is gemarkeerd. De mouwen van het stationaire weefsel dissociator afgebeeld als posities op het beeldscherm van het toestel. Kies de posities monsters op te draaien door erop te klikken op het touchscreen. Druk op "start" om de modus uit te voeren en ga verder met stap 2.16. OPMERKING: Afhankelijk van het type tumor zou een ander dissociatie programma geschikt zijn (zie stap 2.7.1). Observeer een venster met "Beëindiging van het programma" op het scherm. Na afloop van het programma, los C Tube uit de stationaire weefsel dissociator. Incubeer monster gedurende 30 minuten bij 37° C onder continue rotatie, bijvoorbeeld door het gebruik van een buis rotator. Na incubatie hechten C Tube ondersteboven op de mouw van het stationaire weefsel dissociator. Opnieuw zorgen dat het monstermateriaal is gelegen in het gebied van de rotor / stator. Voer het programma dissociatie h_tumor_02 (voor zachte en middelgrote tumoren) of h_tumor_01 (voor harde tumoren) volgens stap 2.7.1. Na afloop van het programma, los C Tube uit de stationaire weefsel dissociator. Incubeer monster gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder continue rotatie. Bevestig C Tube ondersteboven op de mouw van het stationaire weefsel dissociator na incubatie. Opnieuw zorgen dat het monstermateriaal is gelegen in het gebied van de rotor / stator. Voer het programma dissociatie h_tumor_03 (voor zachte tumoren), h_tumor_02 (voor middelgrote tumoren) of h_tumor_01 (voor harde tumoren) zoals beschreven in stap 2.7. Om het monster materiaal te verzamelen op de buis onder het uitvoeren van een short centrifugefase (bij 100 xg gedurende 10 sec). Resuspendeer de cellen en toepassen op een cel zeef met 70 micrometer nesh formaat geplaatst op een 50 ml buis. Was de cel zeef met 20 ml RPMI 1640 en DMEM. Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 7 min. Zuig supernatant volledig. Resuspendeer cellen in 5 ml buffer voor het tellen. Ga door met de muis cel depletie door magnetische celscheiding (deel 3). 3. Muis cel depletie door Magnetic Cell Separation Technology OPMERKING: Volumes voor magnetische kenmerken hieronder gelden voor maximaal 2 x 10 6 tumorcellen of 10 7 totaal cellen waaronder rode bloedcellen. Afhankelijk van de tumorgrootte lagere of hogere aantal cellen worden verkregen. In het geval van minder cellen, maken gebruik van dezelfde volumes zoals aangegeven. Bij het ​​gebruik van een hogere cel aantallen, opschalen alle reagens volumes en de totale volumes dienovereenkomstig (bijvoorbeeld voor 4 x 10 6 tumorcellen of 2 x 10 <sup> 7 totaal cellen, gebruik maken van twee keer het volume van alle aangegeven reagens volumes en de totale volumes). Bepaal het aantal cellen van een monster van cel suspensie in stap 2.21 behulp van een microscoop en geschikte kamer voor het tellen. OPMERKING: Op dit punt de celsuspensie uit een heterogeen mengsel van menselijke tumorcellen en muis stromale en bloedcellen, inclusief rode bloedcellen. De samenstelling van de cellen sterk afhankelijk van het type tumor en omgeving voor transplantatie. Bij het uitvoeren van flowcytometrische analyse na verwijdering van muizencellen trekken 100 ul aliquots geschikte buizen voor een ongekleurd en twee enkele kleurcontrole kleuring voor flowcytometrische analyse. Bewaar ze in de koelkast bij 2-8 ° C tot nader kleuring stappen (deel 4). Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant. Hersuspenderen celpellet in 80 gl buffer per 2 x 10 6 tumorcellen of 10 7totale cellen Voeg 20 ul van de magnetische labeling reagens voor muizencellen. Meng goed en incubeer 15 minuten in de koelkast (2-8 ° C). Tijdens magnetische etikettering, voor te bereiden op grote schaal kolommen (LS kolommen) voor magnetische scheiding, door deze in het magnetische veld van een geschikte magneet (zie tabel van materialen en apparatuur) volgens het protocol van de fabrikant. Spoel de kolom met 3 ml buffer. Stel het monstervolume tot 500 gl buffer gebruikt voor maximaal 2 x 10 6 tumorcellen of tot 10 7 totaal cellen. (Tot 1 x 10 7 tumorcellen of maximaal 5 x 10 7 totaal cellen kunnen worden verwerkt op een LS Column. Bij het ​​werken met meer cellen splitsen het monster op meerdere LS kolommen). Bij het uitvoeren van flowcytometrische analyse, moleculaire analyse of het vergelijken van breuken in culturen, in te trekken een 50 ul monster als ongesorteerd monster. Bewaar het in een koelkast bij 2-8 ° C tot verdere verwerking. </ Li> Toepassen 500 ul van de celsuspensie op de eerder bereide kolom. Verzamel doorstroom bevattende niet gelabelde doelcellen, die het verrijkte humane tumorcellen. OPMERKING: Bij het werken met hogere celaantallen tot 2,5 ml celsuspensie die bereid volgens stap 3.5 kan worden aangebracht op een kolom. Waskolom met 2 x 1 ml buffer. Verzamel de cellen die passeren en samen met het doorstroomkanaal van stap 3,6. Voer wasstappen door toevoeging van 1 ml buffer porties als de kolom reservoir leeg. OPMERKING: De doorstroom bevat gezuiverde humane tumorcellen. Om ook het verzamelen van de muis cellen in de kolom vastgehouden, verwijder kolom uit de afscheider en plaats deze op een geschikte buis. Pipetteer 3 ml buffer op de kolom en direct gebruikt om de plunjer te spoelen de muizencellen door krachtig duwen in de kolom. Spin down van de fracties en de controle monsters bij 300 g gedurende 10 min. aspireren supernatant volledig en resuspendeer cellen in buffer, kweekmedium of pellet bevriezen in vloeibare stikstof, afhankelijk van de gewenste stroomafwaartse toepassing. 4. Downstream Analyses Kleuring voor Flow cytometrische analyse OPMERKING: Alvorens verder stroomafwaarts analyses onderdeel cellen verkregen uit muizen cel depletie procedure kan worden geanalyseerd (bijv beoordelen zuiverheid en opbrengst) in flowcytometrie. Voor flowcytometrische analyses draaien ten minste 10% van negatieve en positieve fractie verkregen door magnetische celscheiding procedure (deel 3) en de controlemonsters verkregen bij stap 3,2 en 3,5 bij 300 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet van de kleuring controlemonsters verkregen bij stap 3.2 in 90 gl buffer. Resuspendeer de fracties verkregen uit magnetische celscheiding procedure 80 pl buffer. Voeg 10 ul van muis FcR Blocking Reagent allesamples. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C in een koelkast. Voeg 10 pl anti-humaan EpCAM-PE (past antilichaam verdunning van 1:10) en 25 gl anti-muis-APC cocktail (past antilichaam verdunning van 1: 4) om de monsters uit paragraaf 3. Voeg 10 ul van anti humaan EpCAM-PE een enkele kleur controlemonster (past antilichaam verdunning van 1:10) en 10 pl anti-humaan EpCAM-APC tot overige (past antilichaam verdunning van 1:10). Meng alle monsters en incubeer gedurende 10 minuten bij 2-8 ° C in een koelkast. OPMERKING: EpCAM is niet geschikt als tumorcel merker van elke tumortype. Voor de tumoren die in deze studie EpCAM-expressie was bekend. Om de monsters te wassen, voeg 1 ml buffer en elke rotatie bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet tot een concentratie van flowcytometrische analyse. Uitsluiten dode cellen toe propidium iodide (1 ug / ml). Voer flowcytometrische analyse met een geschlaag cytometer volgens de protocollen van de fabrikant. Teelt van humane tumorcellen OPMERKING: Naast flowcytometrie kunnen cellen verkregen uit de scheidingsprocedure gekweekt en gebruikt voor verdere testen in vitro. Resuspendeer de gesorteerde fractie uit paragraaf 3 in kweekmedium tot een concentratie van 5 x 10 5 cellen / ml. OPMERKING: Afhankelijk van het type tumor coating, geschikt zaaien dichtheid en teeltomstandigheden kunnen verschillen. Voeg 500 gl celsuspensie in de putjes van een plaat met 24 putjes bekleed met 0,1% gelatine. Incubeer cellen in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5%. OPMERKING: Optimale kweekomstandigheden afhankelijk van het tumortype gebruikt. Daarom gelden kweekomstandigheden geschikt voor het tumortype gebruikt. Immunofluorescentie kleuring van gekweekte cellen Bereid blokkeeroplossing door toevoeging van 10% FCS en 0,1%Triton X-100 tot 1x PBS. Discard kweekmedium. Voeg 500 pl 1x PBS per putje aan cellen te wassen. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (KT), gooi 1x PBS volledig. Fix cellen door toevoeging van 300 pl 4% PFA oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Gooi PFA oplossing. Was gefixeerde cellen 3 keer zoals in stap 4.3.2. Voer permeabilisatie en blokkeren door het toevoegen van 300 ul van het blokkeren per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Gooi blokkeeroplossing. Was de cellen zoals in stap 4.3.2. Voeg 300 gl primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing van de cellen. Antihumaan EpCAM antilichaam verdund 1:40 wordt Vimentine antilichaam verdund 1: 200. Incubeer overnacht bij 2-8 ° C. Opmerking: De gebruikte antilichamen zijn niet geschikt voor elk type tumor als EpCAM niet kan worden uitgedrukt op tumorcellen en / of vimentine wordt ook uitgedrukt door de tumorcellen. Controleer of de gebruikte antilichamen zijn geschikt voor de xenograft model. Gooi primaire antilichaam oplossing. Was de cellen 3 keer zoals in stap 4.3.2. Voeg 300 ul secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing van de cellen. Beide antilichamen, anti-konijnen IgG-Alexe594 en anti-muis IgG-Alexa488 verdund 1: 400. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. Gooi secundair antilichaam oplossing. Was de cellen 2 keer zoals in stap 4.3.2. Voeg 300 gl DAPI-oplossing (0,1 ug / ml) aan elk putje. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Gooi DAPI oplossing. Was de cellen 3 keer zoals in stap 4.3.2. Voeg 500 ul van 1 x PBS aan elk putje. Voeren fluorescentie microscopie met een geschikte microscoop. Exoom Sequencing Voor exoom sequencing (WES) freeze pellets uit stap 3.9 in vloeibare stikstof. Store en het verzamelen van monsters bij -80 ° C. Na het verzamelen van de cellen, uit te voeren exome capturing en exoom volgendeuencing volgens de instructies van de betreffende kit fabrikant (zie tabel van materialen en apparatuur).

Representative Results

Verschillende benaderingen zijn voorgesteld om muizencellen xenotransplantatie van menselijke tumoren identificeren of afbreken, bijvoorbeeld een combinatie van muizen-specifieke antilichamen tegen CD45 en MHC klasse I. Slechts subpopulaties van muizencellen werden gedetecteerd met deze combinaties dat de voorgestelde combinatie gedetecteerd CD45 en MHC klasse I expressie muizencellen en de rest van de muis cellen in doelweefsels voor transplantatie (figuur 1). Gebruik van deze nieuwe combinatie van antilichamen magnetische celsortering, kan menselijke tumorcellen onafhankelijk van het type tumor (figuur 2) worden geïsoleerd. Cellen verkregen van magnetische celscheiding-procedure op basis muizencellijn verwijdering kunnen worden gekweekt, waardoor zuivere kweken van humane tumorcellen (Figuur 4). Daarnaast kunnen levensvatbare muizencellen worden verkregen en gekweekt uit dehetzelfde monster. Naast het verwijderen van muizencellen, werd ook vuil verwijderd van muizen celdepletie (MCD) (figuur 3). Het uitgebreide uitputting van muizencellen en afvalverwijderingssysteem leiden tot verbeterde moleculaire downstream analyses. Dit werd aangetoond door het vergelijken van resultaten van exoom sequencing (WES) uit drie verschillende patiënt afgeleide xenograft tumor modellen (figuren 5-9) op de bulk tumor stukken en muis cel depletie monsters. Onze gegevens geven aan dat de verwijdering van muizencellen alvorens WES op xenograft tumor samples niet alleen verhoogt de totale hoeveelheid leest (figuur 5) maar reduceert het aantal gastheer afgeleide leest toegewezen aan het menselijk referentie genoom (Figuur 6B). Aangezien deze ten onrechte toegewezen muis vaak leest interfereren met SNP roeping, zagen we een sterke reductie van ten onrechte voorspeldeSNPs na MCD (figuren 7-8). Ten slotte hebben we laten zien dat het in silico verwijderen van muis afgeleid leest door bioinformatica methoden kunnen niet volledig vervangen van de experimentele procedure, als een eenduidige-sequentie gebaseerde opdracht om de diersoorten van oorsprong niet mogelijk was voor iedereen leest. Bovendien is de in silico procedure kon corrigeren voor betere kwaliteit en hogere gelijktijdig lezen dekking van de in vitro uitgeputte monsters (Figuur 9). Figuur 1. De oprichting van een Antibody Cocktail Herkennen Alle muizencellen over meerdere Organs 14. Screenings in meerdere organen, waaronder de huid, longen, hersenen, nieren en skeletspieren, zijn uitgevoerd. Deze organen vertegenwoordigen belangrijk doelwit weefsels voor xenotransplantatie. Combinaties zoals die te herkennen mouse CD45 en MHC klasse I epitopen zijn reeds gebruikt om muizencellen afbreken na xenotransplantatie. Echter, deze marker combinaties herkende slechts een subset van muizencellen in alle geanalyseerde weefsels. In vorige screenings een combinatie van vijf antilichamen vastgesteld waardoor de algehele detectie van alle cellen van muizen oorsprong. Dit paneel omvat rode bloedcellen en is onafhankelijk van het weefsel van oorsprong (A, B, en gegevens niet getoond). Gewijzigd ten opzichte van 14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. betrouwbare en snelle uitputting van muizencellen 15. Conjugaten van het antilichaam combinatie met superparamagnetische nanoparticles werden gebruikt om een geoptimaliseerd protocol voor depletie van muizencellen van humane tumor xenotransplantaten ontwikkelen door magnetische celsortering (magnetische celscheiding) (A). Dit nieuwe protocol toegestaan ​​voor de verwijdering van> 99% van contaminerende muizencellen in minder dan 20 min, ongeacht het tumortype. Celfracties verkregen magnetische celscheiding procedure werden gelabeld met de pan-muizenantilichaam cocktail en een specifiek antilichaam tegen humaan CD326 (EpCAM) (B). Gewijzigd ten opzichte van 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Isolatie van menselijke glioblastoom cellen. Mouse Cell Uitputting Kit werd gebruikt voor humane glioblastoma cellen geïsoleerd uit volwassen mouse hersenen. Tijdens de dissociatie van zenuwweefsel grote hoeveelheden puin wordt gewoonlijk gegenereerd. MCDK put efficiënt dode cellen en afval zoals gezien door de plot tonen celgrootte versus cel granulariteit. Met deze conjugaat cocktail, was het mogelijk om te elimineren> 99% van de verontreinigende muizencellen en> 60% van het puin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4. Uitputting van muizencellen Maakt Downstream Culturen van humane tumorcellen 14. Muis fibroblasten vaak belemmeren het kweken van menselijke tumorcellen na dissociatie van getransplanteerde weefsels of leiden tot heterogene culturen. Fibroblasten hechten en uit te breiden efficiënter, waardoor het doel c overgrowing ells. Dit verstoort in vitro celcultuur assays (bijvoorbeeld drug cytotoxiciteit testen), aangezien wiskundige correctie voor effecten van verontreinigende muizencellen is onmogelijk in de meeste gevallen. De negatieve (B) en positieve fracties (C) na muizencellijn depletie werden gedurende drie dagen, gefixeerd en gekleurd voor een muis-fibroblast specifieke marker (Vimentine) en de humane specifieke tumor marker CD326 (EpCAM). Als controle werd de oorspronkelijke fractie die niet gescheiden cellen (A) werd gekweekt en bevlekt ook. Zelfs na drie dagen kweken werd een nagenoeg zuivere populatie van humane tumorcellen waargenomen ontkennend fractie (B), terwijl de gesorteerde fractie (A) bijna overwoekerd door fibroblasten. Slechts een klein gedeelte van doelwitcellen werd verloren van de positieve fractie (C). Gewijzigd ten opzichte van 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5. exoom Sequencing (WES) van tumormonsters Vóór en na Mouse cel depletie (MCD) 15. Wij hebben WES drie verschillende xenograft modellen uit menselijk nier, long en blaaskanker om het effect van op MCD beoordelen de kwaliteit van de next-generation sequencing data. DNA van bulk tumor en van geïsoleerde tumorcellen na muis cel depletie werd gebruikt om exome gevangen sequencing bibliotheken aanbrengen van een exome capture kit te genereren. Voor sequencing op een desktop sequencer instrument, een desktop-sequencer reagens kit 150 cycli, werd gebruikt voor het genereren van 75-bp gepaarde-end leest. Een significante toename (p <0,05) in cluster dichtheid (A) en een average toename in lees tellingen van 33% (B) werd waargenomen voor de uitgeputte van muizencellen monsters, wat aangeeft verbeterde kwaliteit monster. Dienovereenkomstig, kan een sterke reductie van afval en dode cellen na MCD ook aangetoond door flowcytometrie-analyse (zie figuur 3). Gewijzigd ten opzichte van 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6. Mouse cel depletie (MCD) vermindert sterk Aantal Ten onrechte toegewezen Muis Leest na exoom Sequencing (WES) 15. Zoals capture oligonucleotiden gebruikt voor gerichte verrijking van proteïne-coderende sequenties werden ontworpen op basis van het menselijk genoom, een eerste pre- verrijking van DNA-fragmenten van menselijke oorsprong frOM het mengsel van muis en humane cellen werd verwacht. Om het aantal capture oligonucleotiden die kunnen kruishybridisatie met muizen genomisch DNA te beoordelen, voerden we BLAST zoekopdrachten van elke afzonderlijke snelle opname exome probe tegen muizen genoom. De verkregen alignment parameters werden gebruikt om eventuele kruishybridisatie te bepalen. (.. Uitlijning lengte, aantal mismatches, aantal openingen) afhankelijk van de selectiegrenswaarden, we voorspelden een kruisreactiviteit van 5-10% invangprobes met transcripten muis (gegevens niet getoond). Na adapter clipping (trimmomatic v0.32 16), hebben we in kaart gebracht aan de leest van alle monsters tegen menselijke genoom en de muis (BWA v0.7.12 17) en vastberaden hun vermeende oorsprong op basis van de respectieve uitlijning parameters (Linux shell, command-line Perl) (A). Gemiddeld 12% van leest afgeleid van massa tumormonsters werd toegeschreven aan muizencellen. Dit bedrag kan worden teruggebracht tot 0,3% na voorafgaande uitputting van muizencellen (B </strong>). Op gemiddeld 15% van de muis afgeleide leest foutief toegewezen aan het menselijk genoom, overeenkomend met 1,9% van de totale leest de bulk tumormonsters en 0,04% in de geïsoleerde tumorcellen, een sterke positieve invloed van muis celdepletie op downstream analyses kan worden verwacht. Figuur 6B illustreert de gedetailleerde lees- opdracht voor bulk tumor en geïsoleerde humane tumorcellen afkomstig van de blaas kanker xenograft. Gewijzigd ten opzichte van 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7. MCD sterk vermindert het aantal Bedrieglijk Voorspelde SNPs 15. Met het oog op de gevolgen van de muis te bepalen leest toegewezen aan het menselijk genoom, bepaalden wij het ​​aantal predicted SNPs voor de xenograft monsters voor en na MCD. Aangezien er geen gezond weefsel beschikbaar voor vergelijking was, werd een SNP gedefinieerd als een verschil tussen de opeenvolgende monster en de referentie-genoom (hg19). Na verwijdering van dubbele leest, werd SNP en INDEL roeping gevoerd 18 en werd beperkt tot het doelwit van een exome capture kit regio's. 63 ± 10% van alle SNPs voorspelde het leeuwendeel tumormonsters werden niet meer gevonden na muis cel depletie, 18 ± 1% waren specifiek voor de geïsoleerde humane tumorcellen (A). Terwijl de eerste werden voornamelijk veroorzaakt door foutief toegewezen muis leest deze leek te detecteren door hogere aantallen lees- en dus een groter bereik in het geïsoleerde humane tumorcel samples. Dit effect was ook toegankelijk voor voorspelde INDELs (B). Gewijzigd ten opzichte van 15. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur. Figuur 8. MCD Verbetert de Voorspelling van hoge impact SNPs 15. (A) Gevolgen van MCD op SNP voorspelling binnen een-eiwit-coderende exon van de POLA1 gen 19 wordt geïllustreerd. Terwijl ten onrechte toegewezen muis een aantal valselijk voorspeld SNPs leest veroorzaakt in de bulk nierkanker xenograft, werden deze SNPs vermist na MCD. Daarnaast MCD verbeterde ook de voorspelling slagvast SNPs. Bijvoorbeeld leest muis toegewezen aan het menselijk genoom referentie in de bulk tumormonster resulteerde in het verkeerd voorspelde vernietiging van het startcodon van het gen GRIA3 (B). Gewijzigd ten opzichte van 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <p clas s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figuur 9. In Silico Uitputting van Muis-afgeleide Leest niet volledig kan vervangen I n Vitro MCD 15. Het leest voorspelde van de muis oorsprong te zijn werden computationeel verwijderd uit de sequencing data, en SNP roeping werd herhaald. Door deze aanpak het aantal SNPs voorspeld de massa tumormonsters werd aanzienlijk verlaagd van 63% tot 8,5% van het totale aantal SNPs (vergelijk figuur 8). Echter, deze in silico benadering kan niet volledig vervangen in vitro MCD, vooral als de verbeterde kwaliteit monster en de bijkomende toename in lees tellingen en dekking beschouwd. Gewijzigd ten opzichte van 15."_blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

We hebben gemakkelijk methode ongerepte humane tumorcellen uit xenogetransplanteerde tumorweefsel isoleren ontwikkeld. Deze procedure is gebaseerd op de uitgebreide depletie van cellen van muizen oorsprong combineert geautomatiseerde weefsel dissociatie en magnetische celsortering. Naast uitputting van muizencellen ook de hoeveelheid dode cellen en afval wordt aanzienlijk verminderd in de doelcel fractie. Samengevat, deze methode verbetert moleculaire downstream analyses en kweek van humane tumorcellen.

In tegenstelling tot andere methoden, is er geen behoefte aan kennis van tumorcel specifieke markers, aanpassing aan wisselende samenstelling van muizencellen of vestiging van algoritmen. De onderhavige methode is onafhankelijk van de muizenstam en het type tumor. Dus een voorspanning door de isolatie van humane tumor subpopulaties op basis van één humaan specifieke merkers die kunnen variëren in expressie, zoals getoond EpCAM 11, is voorkomened. Bovendien is het niet beperkt tot tumormateriaal maar kan worden gebruikt voor elke vorm van xenogetransplanteerd weefsel muizencellen zijn gericht in plaats van specifieke menselijke tumor subpopulaties (gegevens niet getoond).

Uitgebreide verwijdering van muizencellen wordt vergemakkelijkt door gericht oppervlak epitopen uitsluitend tot expressie gebracht op cellen van muizen oorsprong. Naast de bekende methode voor tumor dissociatie zoals in dit onderzoek, zijn er vele procedures met verschillende soorten enzymen. Behoud van celoppervlakte epitopen is een voorwaarde voor deze nieuwe werkwijze, maar ook voor nauwkeurige analyse van humane tumorcel populaties. Daarom is het cruciaal dat zacht enzymen voor digestie van tumorweefsel. Aldus kan muizencellijn depletie uitsluitend in combinatie met enzymatische digestie procedures die klaarblijkelijk geen invloed epitopen doelwit tijdens muizencel depletie procedure. In geval van twijfel kan dit alleen worden geverifieerd door de betreffende fabrikant.

<pclass = "jove_content"> Deze methode werkt ook voor menselijke circulerende tumorcellen (CTC's). Aangezien frequenties doelwitcellen gewoonlijk <0,1% verwijdering van muizencellen vereist bovendien lysis van rode bloedcellen en zuiverheden van meer dan 50% kan niet worden verwacht. In dit geval kan muizencellijn depletie worden gebruikt als pre-verrijking van CTCs gevolgd door een verrijking behulp van positieve markers (gegevens niet getoond).

Verwijdering van muizencellen verbetert de cultuur van menselijke tumorcellen door het vermijden van cultuur overwoekeren van muizen fibroblasten. Daarnaast is de analyse van humane tumor xenotransplantaten door de volgende generatie sequencing aanzienlijk verbeterd en gestandaardiseerd. Aangezien dit effect werd waargenomen, alhoewel een gerichte menselijke sequentie-specifieke selectie tijdens exome verrijking is uitgevoerd, worden de invloed op het hele genoom en hele transcriptoom sequencing zal naar verwachting nog meer prominente zijn.

Bovendien is de gepresenteerde methode faciliteert Accurate moleculaire studies van tumor subpopulaties binnen xenogetransplanteerd menselijke tumoren. Verwijdering van muizencellen van een respectief monster in de eerste stap en vervolgens sorteren van humane tumorcellen in twee verschillende subpopulaties maakt directe moleculaire vergelijking van de tumor subpopulatie van belang bulk humane tumorcellen 20. Differentiële genexpressie tussen tumorcellen subtypes betrouwbaarder worden beoordeeld als deze niet wordt beïnvloed door kruishybridisatie van muizen afgeleide moleculen.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.

Materials

Tumor Dissociatio Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions
RPMI 1640 Biowest L0501-500
gentleMACS C-Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
MACS SmartStrainer (70 µm) Miltenyi Biotec 130-098-462
Petri dish 100 mm Various
Scalpel Various
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi Biotec 130-104-694
PBS Various use 1x PBS for PEB buffer
EDTA Sigma-Aldrich 3610 use final concentration of 2 mM in PEB buffer
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376 or use 5 mg/L BSA in PEB buffer
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
PreSep filters (70 µm) Miltenyi Biotec 130-095-823
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
CD326-FITC, human Miltenyi Biotec 130-080-301 use 1:40 for immunofluorescence staining 
anti-Vimentin antibody abcam ab92547
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 Life Technologies A11029
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 Life Technologies A11012
DAPI Sigma-Aldrich D9542 dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate 
Inside Stain Kit Miltenyi Biotec 130-090-477 InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining 
FBS Various
Triton X-100  Sigma-Aldrich 93418
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi Biotec 130-092-575
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100g
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit Illumina FC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
  2. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  5. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
  6. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
  8. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  9. Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
  10. Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
  11. Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
  12. Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
  13. Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
  14. Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. . Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , (2014).
  15. Agorku, D., et al. . Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , (2015).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. バイオインフォマティクス. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. バイオインフォマティクス. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).

タグ

Artificial IntelligenceAI Writing AssistantContent GenerationCopywritingText GenerationAI-assisted WritingAI-powered CopywritingAI-generated Content

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Agorku, D. J., Tomiuk, S., Klingner, K., Wild, S., Rüberg, S., Zatrieb, L., Bosio, A., Schueler, J., Hardt, O. Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells. J. Vis. Exp. (113), e54259, doi:10.3791/54259 (2016).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image