从人类肿瘤异种移植的小鼠细胞的消耗显着改善靶细胞下游分析

所有动物实验均按照Regierungspräsidium弗赖堡Referat 35的当地伦理和法律准则进行。 1.试剂准备注：在开始试验之前，准备从离解包以下试剂： 为了制备酶ħ溶解冻干粉末的每个小瓶在3毫升的RPMI 1640罗斯韦尔园区纪念研究所1640（RPMI 1640）或Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）的。为了避免反复冻融制备合适等份（ 例如 ，200微升），并将它们存储在- 20℃下进行长达6个月。 为了制备酶ř溶解冻干粉末的小瓶中2.7毫升RPMI或DMEM培养基。为了避免反复冻融制备合适等份（ 例如，100微升），并将它们存储在- 20℃下进行长达6个月。 为了准备酶溶解在V在1ml缓冲液A的冻干粉末IAL供给与没有涡旋的试剂盒。为了避免反复冻融制备合适等份并在存储（ 例如 ，25微升。） – 20℃长达6个月。请务必要彻底退出所需要的反应体积在此之前暂停，立即混合。 制备250毫升缓冲液（1×PBS中的0.5％BSA）中进行细胞分离过程和抗体染色。 注意：当除去小鼠细胞后培养细胞通过0.22微米的过滤器过滤所有缓冲液和酶溶液。 2.肿瘤离解协议注意：在此研究中的非小细胞肺癌（NSCLC）的患者来源异种移植物，肾癌和膀胱中使用。如前所述13 6周龄雌性NMRI nu / nu小鼠-通过注入肾癌非小细胞肺癌的异种移植物（NSCLC）和膀胱中4分别产生的肿瘤</s了>。 注意：作为该协议是完全独立于肿瘤类型的，它可用于任何类型的患者或细胞系衍生的肿瘤以及其他类型的人类异种移植组织的未经协议的修改。 制备5-毫升，每组织样品消化混合（高达1克）新鲜加入4.7毫升的RPMI 1640或DMEM，200微升酶H型，100微升酶的R，和25微升酶A的成蜂窝解离管（ C封装Tube）。确保收回所需要的卷之前调匀酶 – [R停牌。 牺牲麻醉下颈椎脱臼的动物。通过用80％V / V乙醇少量喷雾消毒鼠标。 嘉实皮下肿瘤使用镊子和剪刀在组织培养罩鼠标的侧翼。切开皮肤代替用剪刀肿瘤的开放，然后使用镊子和剪刀从邻近的健康组织的肿瘤中分离出来。 注：根据的目的该实验在无菌条件下执行此和以下步骤。在这项研究中的所有步骤都在顺序在无菌条件下的细胞培养罩进行，以能够培育细胞。 通过去除脂肪（因为这会使示例float）和坏死区（因为这会导致活力下降），将其截走使用镊子和手术刀准备消化肿瘤样品。用手术刀和镊子4毫米 – 剁碎组织成2块。 转移组织块放入含有消化混合的C管。 关闭C封装Tube并确保它被紧紧关闭。附加它倒置到台式组织离解器的套筒，并确保该组织片位于转子/定子的面积。 按“向上”或“向下”按钮，直到模式出现在显示屏上，然后按“开始”按钮，选择模式“h_tumor_01”。 如果你唱台式组织离解的加热功能，确保还附上加热器。然后通过点击触摸屏上的文件夹符号直到文件夹“美天旎”出现运行模式37C_h_TDK_1（软肿瘤），37C_h_TDK_2（用于中等肿瘤）或37C_h_TDK_3（硬肿瘤）。 要选择模式，请单击向上或向下箭头，直到离解模式37C_h_TDK_2高亮显示。的台式组织离解的套筒被描述为在设备的显示器上的位置。选择样本通过单击它们在触摸屏上运行的位置。按下“开始”运行模式，并继续执行步骤2.16。 注：根据不同的肿瘤类型另一个分离程序可能是合适的（见步骤2.7.1）。 观察显示在屏幕上的“节目的终止”的窗口。节目结束后，分离从台式组织离解C封装Tube。 孵育样品在37 30分钟°℃下在连续旋转， 例如 ，通过使用一管肩。 孵化后附上C封装Tube倒挂到台式组织离解的袖子。再次确保样品材料位于转子/定子的面积。 运行程序分解h_tumor_02（软，中肿瘤）或h_tumor_01（硬瘤），按步骤2.7.1所述。 节目结束后，分离从台式组织离解C封装Tube。 孵育样品下连续旋转，在37℃30分钟。 附加C封装Tube倒挂到孵化后的台式组织离解的袖子。再次确保样品材料位于转子/定子的面积。 运行的解离方案h_tumor_03（软肿瘤），h_tumor_02（用于中等肿瘤）或h_tumor_01（硬肿瘤）如在步骤2.7中描述。 收集样品材料在试管底部进行抄室温离心步骤（在100×g离心10秒）。 重悬细胞，并适用于细胞过滤，用70微米置于50ml管NESH大小。用20ml的RPMI 1640或DMEM中洗涤细胞过滤。 在300×g离心7分钟离心细胞悬浮液。吸完全上清。 悬浮细胞在5ml缓冲的计数。通过磁性细胞分离（第3节）小鼠细胞耗竭继续。 3.磁性细胞分离技术小鼠细胞耗竭注意：下面给出的卷为磁标记是长达2×10 6个肿瘤细胞或10 7个总细胞包括红细胞。根据肿瘤大小更低或更高的细胞数，将获得。在较少的细胞的情况下，使用相同的卷所示。当使用更高的细胞数量，扩大规模的所有试剂卷和卷总额相应（ 例如，4×10 6肿瘤细胞或2×10 <suP> 7个细胞，利用一切表明试剂体积和总体积）的两倍音量。 确定从细胞悬浮液，在步骤2.21使用用于计数显微镜和合适的腔室中的等分试样的细胞数。 注意：此时的细胞悬浮液由人肿瘤细胞的异质混合物的以及小鼠基质和血细胞，包括红细胞。细胞的组合物在很大程度上取决于肿瘤类型和区域用于移植。 在进行流式细胞仪分析后去除小鼠细胞中撤出100微升等分适合用于管未染色和两个单色彩控制染色的流式细胞仪分析。 8°C，直到进一步的染色步骤（第4节） – 在2冰箱保存。 在300×g离心10分钟，离心细胞悬浮液。弃去上清液。 在80微升每2×10 6个肿瘤细胞或10 7缓冲液重悬细胞沉淀总细胞加入20μl磁性标记试剂的小鼠细胞。 拌匀，孵育在冰箱15分钟（2 – 8°C）。根据制造商的方案中的磁性标记，制备用于磁分离大规模柱（LS柱），通过将其放置在一个合适的磁体的磁场（见材料和​​设备的数据表）。用3毫升缓冲液冲洗该柱。 调节使用缓冲器的样品体积为500微升长达2×10 6个肿瘤细胞或高达10 7总细胞。 （最多1×10 7个肿瘤细胞或高达5×10 7个总细胞可以在一个LS柱进行处理。当与多个小区工作分裂样本到多个LS柱）。 在进行流式细胞仪分析，分子生物学分析或文化比较分数，取消50微升等分作为未分类的样本。 8°C，直到进一步的处理 – 在2冰箱储存。 </ LI> 应用500微升的细胞悬液到预先制备的柱。收集流过含有未标记的靶细胞，分别代表富集的人肿瘤细胞。 注意：当具有更高的细胞数的工作至2.5 ml的细胞悬浮液被按照制备步骤3.5可应用于一列。 用2×1毫升缓冲液洗柱。收集穿过所述细胞，并与流过来自步骤3.6结合。通过只要柱储层是空加入1毫升缓冲液的等分试样进行清洗步骤。 注意：通流包含纯化的人肿瘤细胞。 为了还收集保留在柱子的小鼠细胞，从分离器中删除列，并将其放置在合适的管子。吸管3毫升缓冲液上柱，并立即用柱塞由力推入柱冲洗掉的小鼠细胞。 降速的级分和对照样品在300×g离心10分钟。吸苏佩完全rnatant和在缓冲液，培养基悬浮细胞或在液氮中冷冻沉淀，这取决于所期望的下游应用。 4.下游分析 染色流式细胞仪分析 注：在进行进一步下游分析之前，从小鼠细胞耗竭过程获得的细胞中的一部分可以被分析（ 例如 ，评估的纯度和产率），在流式细胞仪。 用于流式细胞分析，在300 XG自旋3.5从磁性细胞分离过程（部分3）中得到的阴性和阳性分数，以及来自步骤3.2的对照样品和至少10％的10分钟。 弃去上清液。在90微升缓冲液中重悬染色的对照样品的细胞沉淀从步骤3.2。重悬在80μl的缓冲液中从磁性细胞分离过程中得到的级分。 加10μl鼠标FcR阻断剂的所有样品。拌匀，孵育在2 5分钟 – 8℃的冰箱中。 添加抗人EpCAM-PE的10微升（等于1:10抗体稀释）和25μl的抗小鼠-APC鸡尾酒（等于1抗体稀释度：4），以从部分3的样品中添加10微升抗 – 人EpCAM的聚乙烯对单一颜色对照样品（等于1:10抗体稀释）和10μl抗人EpCAM-APC到其他的（等于1:10抗体稀释）。混合所有样品，孵育在2 10分钟 – 8℃的冰箱中。 注：EpCAM的不适合作为任何肿瘤类型的肿瘤细胞的标志物。在这项研究的EpCAM表达式中使用的肿瘤是众所周知的。 洗样品，在300 xg离心加各1ml缓冲液和自旋5分钟。 弃上清，重悬细胞沉淀用于流式细胞仪分析的浓度。以排除死细胞添加碘化丙啶（1微克/毫升）。 使用合适˚F进行流式细胞仪分析根据制造商的协议低血细胞计数。 人类肿瘤细胞的培养 注意：除了流式细胞仪，从分离过程得到的细胞可以培养并用于体外进一步的测定。 重悬在培养基中部分3的排序馏分的5×10 5细胞/ ml的浓度。 注意：根据肿瘤类型涂层，适合接种密度和培养条件可有所不同。 加入500微升细胞悬浮液到涂有0.1％明胶24孔板的孔中。 孵育在细胞培养孵化器细胞在37℃和5％。 注：最佳培养条件取决于所用的肿瘤类型。因此，申请适合使用的肿瘤类型的文化条件。 培养细胞的免疫荧光染色 制备通过添加10％FCS和0.1％封闭溶液的Triton X-100的1X PBS。 丢弃培养基。加入500μl1X PBS，每孔洗细胞。孵育在室温（RT）下2分钟，然后完全丢弃1×PBS中。 通过加入300微升4％PFA溶液固定细胞。孵育在室温下进行15分钟。 丢弃PFA解决方案。洗固定的细胞3次，如在步骤4.3.2指示。 加入300微升每孔堵塞的执行通透性和阻塞。孵育在室温下进行30分钟。 丢弃封闭溶液。洗涤细胞如步骤4.3.2指示。 添加第一抗体以300μl阻断溶液至细胞稀释。抗人EpCAM抗体稀释1:40，波形蛋白抗体稀释1：200。 8°C – 在2孵育过夜。 注意：使用的抗体不适合任何肿瘤类型如EpCAM的可能不会对肿瘤细胞和/或波形蛋白表达也由肿瘤细胞中表达。确保使用的抗体是适合于异种移植物莫德尔。 丢弃第一抗体溶液。洗涤细胞3次，如在步骤4.3.2指示。 添加二级抗体以300μl阻断溶液至细胞稀释。两种抗体，抗兔IgG-Alexe594和抗小鼠IgG-Alexa488稀释1：400。孵育在室温黑暗1小时。 丢弃第二抗体溶液。洗涤细胞2次，如步骤4.3.2指示。 加的DAPI溶液300微升（0.1微克/毫升）至各孔中。孵育在室温黑暗中10分钟。 丢弃DAPI解决方案。洗涤细胞3次，如在步骤4.3.2指示。 添加500μl的1×PBS中的每个孔中。使用合适的显微镜进行荧光显微镜。 全基因组测序 对于从步骤3.9液氮全外显子测序（WES）冻结颗粒。存储和在-80℃收集样本。 收集细胞后，执行外显子组捕获和整个外显子组以次根据对各试剂盒的制造商的说明uencing（见材料和​​设备的数据表）。