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概要
이 문서에서는 성공적으로 항균 약물 발견 및 화합물 테스트를위한 새로운 강력한 도구를 제공, 녹농균에 순환 디 GMP의 세포 수준을 조작 할 수있는 잠재적 능력을 작은 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝하기 위해 설립 된 높은 처리량 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
기존의 항생제에 대한 세균의 저항은 최근에 발견 된 규제 경로에 새로운 약물 표적을 식별하는 연구 시도를 주도하고있다. 두 번째 메신저로 세포 내 순환 디 GMP (C 디 GMP)를 이용 규제 시스템은 목표의 하나의 클래스입니다. C 디 GMP는 항생제 내성, 바이오 필름 형성 및 독성을 포함한 프로세스의 광범위한 범위를 조절하는 작용을 거의 모든 세균에서 발견되는 신호 분자이다. C 디 GMP는 항생제 내성 바이오 필름 개발의 제어 측면을 신호 방법의 이해는 뉴클레오티드 또는 이러한 신호 전달 경로의 중단의 세포 농도의 변화가 감소 biofilm 형성 또는 항생제에 생물막의 증가 감수성으로 이어질 수있다 접근 방식을 제안했다. 우리는 녹색 형광 단백질 발현을 c 디 GMP 응답 CDRA 프로모터의 제어하에 (GFP)에 기초하여, 간단한 높은 처리량 bioreporter 프로토콜을 설명, 녹농균 (P. aeruginosa의)에서 C 디 GMP 세포 수준을 조절 할 수있는 잠재력을 가진 작은 분자 빠르게 화면입니다. 이 간단한 프로토콜은 48 시간 내에 상향 3,500 화합물의 화면을 복수의 미생물에 적용 할 수있는 능력을 가지고있다.
Introduction
임상 적으로 중요한 항생제에 대한 박테리아의 내성의 급속한 발전은 현재 전 세계적으로 보건 전문가가 직면하고있는 주요 문제 중 하나입니다. 기존의 항생제이 오류는 독성과 질병의 진행 일에 관여하는 세균 프로세스를 방해 할 수있는 화학 물질에 대한 새로운 검색을 주도하고있다. 활용 한 이러한 규제 체계 세포 내 디 GMP (C 디 GMP)는 최근 유망 유효 2-4와 대상이되었다 순환 두 번째 메신저. 이 글로 제 톡 신호 분자는 항생제 내성, 접착 성 바이오 필름 형성 및 질환 2-4 포함한 여러 기능을 조절하는 것으로 확립되어있다.
이제 박테리아 세포에서 C 디 GMP의 세포 수준은 GTP 두 분자 GGDEF 도메인 함유 diguanylate cyclases (DGCs) WH 의해 C 디 GMP를 합성하는 데 사용된다 합성과 분해에 의해 제어됨을 알 수있다ereas C 디 GMP 저하가 EAL 또는 HD-GYP 도메인 중 하나가 포스 포 디에스 (하는 PDE)에 의해 촉매된다 ((3 검토, 5)). 이러한 도메인을 포함하는 단백질은 종종 C 디 GMP 매출에서의 활동이 환경 또는 휴대 단서 3,5에 의해 직접 또는 간접적으로 조절되는 것을 건의, 다른 신호 도메인이 포함되어 있습니다. 따라서, C 디 GMP는 세균 표현형의 수정에 다양한 환경 단서의 감지를 연결하는 기능을 신호. C 디 GMP는 다양한 메커니즘 (4)에 의해 전사, 이후 전사 및 사후 번역의 수준에서 박테리아의 규제 효과를 발휘한다.
많은 박테리아 세포에서 C 디 GMP의 주요 영향은 생물막의 다세포 구조의 표면에 부착 또는 조직 운동성 플랑크톤 세포와 고착 세포 사이의 전환의 제어에, 특히 박테리아 '라이프 스타일'과의 결정에 3,5. 일반적으로, 높은 휴대낮은 세포 수준은 많은 세균 병원균 3,5의 운동성 및 독성 인자의 합성을 촉진하는 동안 C 디 GMP 수준은 biofilm 형성 및 sessility과 연결되어 있습니다. 따라서, C 디 GMP 신호의 동작의보다 상세한 기술은 병원성 세균의 바이오 필름 형성 및 독성 억제 전략을 수득 할 수있다. 이것은 대부분의 박테리아 게놈이 GGDEF, EAL 및 / 또는 HD-GYP 도메인 (예를 들어, 녹농균이 40 단백질이) 여러 이펙터 6,7 수많은 단백질을 인코딩 주어진 어려운 작업입니다.
그러나, 이러한 복잡성으로, 최근의 증거는 C 디 GMP 시그널링 조작 전략 항생제 내성 감염 현상을 방지하거나 고전 항생제 (2)의 병용 투여에 의한 면역 시스템 또는 효과적인 치료에 취약하게 하나에 개발 될 수 있음을 시사한다. 이와 라인에서, 실험적 인공 감소하는 것이 증명되었다체외 -grown P.의 세포 내 C 디 GMP의 P. aeruginosa의 동안은, 바이오 필름 형성을 감소 항균제에 대한 감수성 증가에 이르게 마우스의 복강에 위치한 실리콘 보형물에 루기 노사 -developed 생물막은, 유사한 방식으로 8-11에 분산 될 수있다.
여기서는 잠재적 P.에서 셀룰러 C 디 GMP 수준을 조절할 수있는 작은 분자를 스크리닝하기 위해 높은 처리량, 형광 기반 리포터 분석을 서술 녹농균 (그림 1). 상기 분석은 C 디 GMP를 발현 전사적 ㄴ 디 GMP 응답 CDRA 촉진제 (12)에 연결되어있는 이전에 개발 된 GFP 리포터를 사용하여 세포 농도를 측정에 기초한다. 이 프로토콜은 P.의 리포터 구조물의 발현을위한 방법을 설명 관심 aeruginosa의 변형, 화합물 판 준비, 우리로 384 웰 플레이트, 성장 조건으로 배양 접종데이터 수집, 관리 및 분석 (그림 1)에 대한 세부 사항과 같은 게요. 전반적으로,이 프로토콜은 박테리아에 신호 C 디 GMP를 대상으로 새로운 화합물을 식별 잠재적으로 연구를 돕기, 연구에 사용 P.의 생물학을 이해를 목표로합니다 녹농균.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균 감염의 치료를 개선하기 위해서, 분자 레벨에서 규정 세균 동작에 대한 이해가 요구되는 것은 명백하다. 여기에 설명 된 절차를 조작하거나 박테리아 C 디 GMP의 세포 농도를 방해 할 가능성이있는 작은 분자를 발견하고자하는 미생물, 생화학 및 임상에 도움이 될 것이다. 상기 방법은 P. C의 디 GMP의 세포 수준을 모니터링하기 위해 최근 개발 된 GFP bioreporter를 이용 녹농균 12. 이 때 중요한 것은 bioreporter는 배양 5 % LB의 PBS에 사용되는 균주의 성장에 영향을 미치지 않도록 검증되고 도시되었다. 생체 내에서 C 디 GMP 수준을 변경하는 작은 분자를 식별하는 전체 셀 스크린의 사용은 특히 그람 음성균들 통해 박테리아 세포막을 통해 분자의 침투면에서 목표 기반 신약 개발의 주요 어려움을 극복 . 중요한 것은, t그는 분석 0.5이 최신 모든 화면에서 관찰되었다 지속적으로 위의 강력한 Z '값으로 매우 강력한 나타납니다. 억제 및 / 또는 세포 내 P. C 디 GMP 수준을 촉진 작은 분자들을 드러내이 프로토콜을 이용하여 스크리닝 녹농균. 또한,이 분석은 살균 또는 OD 600 독출 감소 결과 제균 화합물을 식별하는 잠재력을 갖는다.
프로토콜 절에서 설명하지 않지만 실험의 제조를위한 몇 가지 중요한 고려 사항이된다. GFP의 bioreporter이 플라스미드를 기반으로 명심하는 것이 중요합니다. 리포터 플라스미드를 P. 매우 안정한 것으로 알려져 있지만 녹농균, 그것은 따라서, 연속 재 도금 후 C 글리세롤 스톡 °에서 -80 갓 도금 균주를 사용할 필요가 분실 형광 발현을 확인하는 것은 중요 할 수있다. 이 화면 전체에서 균일 한 성장 조건을 유지하기 위해 매우 유용이러한 조건에서 어떤 변동이 화면에 노크에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 이 매체와 항생제 배치에서 사전 제작하고 화면의 과정 전반에 걸쳐 사용되는 특정 만드는 포함한다. 세균성 문화 균일 한 방식으로 (OD 600 읽기 아웃 기준) 성장하지 것은이 자연의 가장 높은 처리량 화면에 대한 일반적인 문제입니다. 이 효과 또는 판으로 비 균일 박테리아 문화를 분배 가장자리로 인해 수 있습니다. 전자의 경우, 배양시 사용되는 가스 투과성 시일이 중요하다 확인하고. 후자, 문화의 부피와 액체 핸들러 튜브를 프라이밍 동안 적어도 세 시간은 튜브 자체의 죽은 볼륨을 권장합니다. 분배하는 동안 최소한의 속도로 자석 교반기를 유지하는 것이 중요하다. 모니터링하고 실험에 걸쳐 일관된 성장 384- 웰 플레이트의 기억이 가장 중요하지만, 방지하는 상황이 해제를 일으킬 수있는 동안 배양 판의 적층이며성장 패턴의 왜곡으로 이어지는 산소 그라디언트를 원했다. 이는 대조군으로 사용되는 DMSO 비히클 부정적인 관심의 균주의 성장에 영향을받지 않도록하는 것이 중요하다. 성장과 관련된 많은 문제점이 검사 전에 관심의 균주와 모의 화면을 수행함으로써 방지 될 수있다. C 디 GMP 억제 결과 세포 밀도의 변화를 수정해야 임의의 형광 강도의 단위 변화에 의해 계산되는 주어진 또한 데이터 해석 장점 고려. 이에 숙지 다른 수식이 실험에서 출력 된 데이터가 또한 고려되어야 평가한다. 예를 들어, 화합물은 C-디 GMP 억제제로 나타날 수 있지만, 실제로는 식별 히트 신중한 해석을 필요로 성장 억제제 또는 그 반대가 될.
이것의 개발 및 성능시 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다높은 처리량 셀 기반 화면. 예를 들어, 검출 가능성 특성 화면에서 사용하는 작은 분자에 의해 영향을받을 수있는 형광 프로브를 사용하여 셀룰러 C 디 GMP 수준의 간접 측정에서 생체 리포터 기능한다. 접선 문제는 세포 기반 분석법은 세포 내 C 디 GMP의 레벨 변화 뒤에기구에 관하여 어떠한 정보를 제공하지 않는다는 사실이다. 따라서, 실험에서 중요한 관찰은 박테리아 세포 내 C 디 GMP 변동을 측정하기위한 "금 표준"에있어서 고려하는 고성능 액체 크로마토 그래피 질량 분석 방법을 이용하여 확인한다. 세균 세포 (생체 내) 호스트의 맥락에서 성장 더욱이 우리 절차는 시험 관내에서 성장 세균의 행동에 관한 정보를 제공 할 수있다 빨리 인해 환경 활동을 수정합니다. 또한, GFP에 bioreporter를 사용하는 프로세스는 화면하지 않는 수단박테리아 세포의 계정에 생리 학적 상태를 표시합니다. 그러나, 프로토콜은 화면 중에 개별 웰 미세 모니터링하도록 구성 될 수있다.
심지어 이러한 고려 사항 및 제한 사항이 높은 처리량 분석은 아직 세포 내 C 디 GMP 수준을 방해 할 수있는 작은 분자에 대한 강력한 화면입니다. 많은 병원성 세균을 포함한 많은 미생물 종 세포 C 디 GMP 수준의 변조를 특성화하기 위해 연구되어 있기 때문에, 우리의 프로토콜은 다양한 세균 종에 적용하고보다 복잡한 multispecies 박테리아 모델 연구로 확장 될 수있다. 상기 분석은 쉽게 성장 조건을 사용하거나 다른 bioreporters를 사용하여 다른 출력을 판독하도록 구성 될 수 변경하여 다른 세균 종에 대해 최적화 될 수있다. 다양한 배양 시간은 관심의 성장 단계에 따라 적용될 수있다. 최대 크기를 조절하거나 관통 넣어 증가 그러나, 그것은 importan입니다 t는 박테리아가 여전히 판 준비 및 판독 측정하는 동안 성장한다 염두에 두어야합니다. 따라서이 프로토콜을 사용하여 한번에 15 판 최대 스크리닝 할 것을 권장한다. 또한, 이상의 384 우물에 플레이트를 사용하여 추가 최적화를 필요로 균일 한 성장을 허용하지 않을 수 있습니다. 플레이트의 수를 확장 할 때, 수동 전자 피펫 대신 액체 핸들링 로봇을 이용하여 접종하는 것이 더 적절할 수있다. 이 프로토콜은 안티 생물막 화합물 C 디 GMP 신호 간섭하여 주어진 생물막 분산 소분자를 조사하는데 사용될 수 있음을 알 수있다. 프로토콜은 또한 세균 생리학의 다양한 양태를 재개발 이해 될 수있다. 주어진 C 디 GMP 시그널링은 우리가 그들의 작동 메커니즘 C 디 GMP 시그널링을 필요로하는지 여부를 결정하기 위해 다른 화학적 자극을 식별 할 수있는이 프로토콜을 사용하여 이들 미생물의 physiologies을 연구함으로써, 대부분의 세균에 보급된다.
_content는 "> 요약하면,이 프로토콜에 제시된 방법의 견고성과 기능성은 C 디 GMP 많은 생물학적 시스템에서 신호의 화학 변조기의 식별에 도움이됩니다.開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Materials
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
| 100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
参考文献
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