調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em>緑膿菌</em

注：精製したc-ジ-GMPレポータープラスミドのクローニングおよび形質転換のための手順は、他の場所で12議論されています。 GFPタグ付きのc-ジ-GMPレポーターPの1世代緑膿菌のひずみ P.の単一コロニーをLB培地（LB）培地5mlに接種200 rpmで振盪しながら37℃で一晩を緑膿菌とインキュベートします。 移送2 1 Lフラスコ中の新鮮なLB培地200mlに一晩培養物1ml及び200rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。 フラスコから1ミリリットルのサンプルを取ることによって、30分ごとに（OD 600）600nmでの光学密度を監視し、（以前に12のように）分光光度計を用いて調べます。 OD 600が 0.3の間に達すると- 0.5、50ミリリットルコニカル遠心チューブに培養液の40ミリリットルを配置します。 4℃で10分間、8,000rpmで遠心分離して細胞をペレット、上清およびRを捨てます氷のように冷たい、滅菌、300mMのスクロース溶液40ml中で細胞を電子サスペンド。 ステップ1.5で説明し、氷冷滅菌、300mMのスクロース溶液20mlに再懸濁として遠心分離して細胞をもう一度ペレット。 ステップ1.5で説明し、氷冷滅菌、300mMのスクロース溶液400μlの再懸濁として遠心分離して細胞を最終的な時間をペレット化。 注：この時点で細胞密度がミリリットル当たり約1×10 11コロニー形成単位（CFU / ml）であるべきです。 彼らはエレクトロポレーションのために準備ができているた後、氷上で30分間細胞を冷やします。 Pの40μlに0.2μgの/μlのpCdrA :: GFPの Cプラスミド 12溶液1μLを追加緑膿菌のエレクトロコンピテント細胞を氷上で予備冷却されている1.5ミリリットルマイクロチューブに上記で調製しました。サスペンションを混合し、予め冷却し、2mmの電極間隔、エレクトロポレーションキュベットに移します。 注：pCdrA :: GFP </em> C：pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP（MUT3）-T 0 -T 1に 、アンプはP.にc-ジ-GMPの細胞内レベルの蛍光読み出しを与えるのGm rを 、rは 緑膿菌の菌株は、Rybtke らによって開発され、検証された。12。 ティッシュペーパーでキュベットの外側に水分を除去し、エレクトロポの試料室にキュベットを配置します。 2.5 kVで、25μFの容量と200Ωの抵抗の電圧にパルス。 キュベットを削除し、LB培地1mlを加えます。その後、滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を移し、200rpmで振盪しながら37℃で2時間インキュベートします。 10μL、50μL及び（100μg/ mlの濃度で）、アンピシリンを補足した滅菌LB寒天プレート上に培養物100μlアリコートを広げ、37℃で一晩プレートをインキュベート。 （excitatiをGFPの発現を確認485 nmで、520 nmでの発光）で、標準的なGFPチャネルで蛍光顕微鏡下でプレートを調べることによって、上と5ミリリットルのLBを接種するために、単一のコロニーを選びますステップ1.1で説明したように一晩インキュベートします。 -80℃でトップチューブとストアをネジ2ミリリットルで0.5ミリリットル50％グリセロールで一晩培養液0.5ミリリットルを混ぜます。 接種のためのスターター文化の調製二日画面の前に、Pをプレート緑膿菌株から（pCdrA :: GFP Cプラスミドを含む）-80 LB寒天プレート上にCの株式°優しく滅菌接種を用いてプレート上に細菌を広げることによって（100μg/ mlの濃度でアンピシリンを添加）ループ。 37℃で一晩プレートをインキュベートします。 スクリーニングの前に夕方、Pの単一コロニーを接種TUで（100μg/ mlの濃度のアンピシリンを補充した）10 mlのLB培地中にプレートから緑膿菌であることと、200rpmで振盪しながら37℃で前培養一晩インキュベートします。 画面の日に、OD 1.0の600に新鮮なLB培地で最初に希釈した後、さらに0.04のOD 600（午前1時25分比）に5％LBで希釈して一晩前培養から継代培養を準備。 注：接種培地の総体積は、試験されるプレートの数に依存します。 5％LBを必要な濃度にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて100％LBを希釈することによって行われます。重要なのは、メディア（5％LB）はpCdrAの構成的活性化を可能にする:: P.におけるGFP のC 緑膿菌 。 それらは、384ウェルプレートに分配する前に細菌を培地に順応できるように、室温で30分間マグネティックスターラーで最小の速度で培養物を容器内に無菌磁気撹拌棒を加え、撹拌します。 含む384ウェルプレートの3接種とインキュベーション小分子注：無菌性と良好な無菌技術は、次のステップに最も重要です。 陽性対照（100％阻害）を調製するには、ステップ2.3で調製したサブカルチャーの10ミリリットル（最大12枚のプレートに十分な）に20μlの硫酸トブラマイシン（25ミリグラム/ ml）を加え、穏やかに混合します。ピペットでウェルにポジティブコントロール培養物の40μlのA23 – P23（ 図2）。 陰性対照（0％阻害）を調製するために、ステップ2.3で調製した継代培養10mlの（最大12プレートのために十分な）に30μlのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加し、穏やかに混合します。ピペットでウェルに負の対照培養40μlのA24 – P24（ 図2）。 P22（ 図2） -小分子を刻印プレートの各々について、ウェルA1に（ステップ2.3で説明）で希釈し、一晩培養液の40μlの量を接種します。 注：これは、液体ハンドラ奪うを用いて達成することができますオト。細菌培養物の不均一な特性には、分配しながら常に媒体に分散細菌を維持するために連続的で穏やかな攪拌を維持することが重要です。これを行うには、磁気分配中のステップ2.4​​からの馴化培地を攪拌し続けます。 通気性カバーシールでプレートを密封し、37℃で6時間インキュベートします。 注意：通気性シールは384ウェル全て渡って不変条件を維持するために、プレート全体に酸素勾配の潜在的な開発を回避することが重要です。 4.成長の測定（OD 600）および細胞内c-ジ-GMPレベル（GFP） 分光光度測定の前に約30分、凝縮を避けるために37℃にプレートリーダーを予め温めます。 ゆっくり読む前に空気透過性のカバーシールを取り外します。ウェル当たり10フラッシュの設定で波長600nmでの光学密度を測定し、0.2秒のセトリング時間。 蛍光を測定する前に基づいて自動利得及び焦点調整を行うだけでなくA24（負の対照）および75％（ 図2）におけるゲイン目標値を設定します。 プレートリーダ制御ソフトウェアから、測定開始をクリックして、 ''フォーカスと利得調整/プレートのID ''タブをクリックします。 ウィンドウの右側にある ''ピント調整 ''と ''チャネルA ''を選択します。 '' 'ゲイン調整' 'と' 'よく選択' 'を選択して、' '目標値」として' '75' 'を入力します。最後に、 ''調整を開始します ''をクリックする前に、プレートレイアウトでよくA24を選択します。調整が行われると、 '' '測定を開始」をクリックします。 ウェル当たり10フラッシュの設定で520分の485 nmでの励起/発光極大とsettliでGFPレポーターからの蛍光を測定します0.2秒のngの時間。 調べた全てのプレートからのデータを収集します。注意：データの読み取りは、自動的にプレートリーダ制御ソフトウェアにより、デフォルトとして保存されます。 統計解析パッケージを開くには、制御ソフトウェア内の「火星」アイコンをクリックして表示朗読。 分析用のデータにアクセスするには、関心のナンバープレートの「ダブルクリック」して、データを取得します。 5.データ解析ハイスループットスクリーニングのために報告された最も一般的な品質メトリクスである堅牢なZ '分析を用いて、アッセイの均一性と再現性を評価します。堅牢なZ 'の式を使用して計算します。 MAD（中央絶対偏差）はOD 600とGFP V両方の標準偏差、pは正の対照（100％阻害）であり、nは、陰性対照（0％阻害）の推定値でありますalues​​。注：0.5以上（OD 600とGFP生データの両方について計算）堅牢なZ '値を用いたアッセイは、優れた分析として考えられています。 式を用いて増殖の阻害％を計算します。 どこXiのOD600は、各サンプルウェルの反復OD 600の値です。 ％阻害OD600> 0、成長阻害剤; ％阻害OD600 <0、成長促進剤。 式（任意の蛍光強度単位の変化は、細胞密度の変化を補正している）を用いてc-ジGMPの細胞内レベルの％阻害を評価します。 XiのGFPは、各サンプルウェルの反復GFP値です。 ％阻害GFP> 0、c-ジGMP阻害剤; ％＆＃160;阻害GFP <0、c-ジ-GMPプロモーター。 データポイントの正規分布を仮定し、各プレートのサンプルよく読んでアウトから算出された中央（中央値±3 MAD）から3 MAD、でヒット検出のためのしきい値を設定します。注：必要な場合は、±50％阻害のカットオフは、より再現性及び正確な用量反応アッセイのために選択することができます。