JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Published: September 13, 2016
doi:
10.3791/53927
, , , , , , , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre

概要

Epitelio pigmentato retinico (RPE) strategie di sostituzione e la terapia genica basati sono considerati per diverse condizioni degenerative della retina. Per la traduzione clinica, modelli di grandi dimensioni occhio animali sono tenuti a studiare tecniche chirurgiche applicabili nei pazienti. Qui vi presentiamo un modello di coniglio per la chirurgia sottoretinico orientata verso il trapianto di RPE, che è versatile ed economico.

Abstract

Età degenerazione maculare correlata (AMD), retinite pigmentosa e altre malattie legate RPE sono le cause più comuni per la perdita irreversibile della vista negli adulti nei paesi industrialmente sviluppati. RPE trapianto sembra essere una terapia promettente, in quanto può sostituire RPE disfunzionale, ripristinare la sua funzione, e così la visione.

Qui si descrive un metodo per trapiantare un monostrato RPE coltivate su un'impalcatura nello spazio sottoretinico (SRS) di conigli. Dopo xenotrapianti vitrectomia stati erogati nella SRS utilizzando un tiratore misura costituito da un ugello metallico calibro 20 con politetrafluoroetilene (PTFE) stantuffo rivestito. La tecnica attuale si è evoluta in oltre 150 ambulatori di coniglio più di 6 anni. Post-operatorio di follow-up può essere ottenuto utilizzando non invasivo e ripetitivo imaging in vivo come dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT) seguita da esame istologico perfusione-fisso.

thMetodo e ha passi ben definiti per facilitare l'apprendimento e alto tasso di successo. I conigli sono considerati un grande modello animale occhio utile negli studi preclinici per la traduzione clinica. In questo contesto, i conigli sono un costo-efficiente e forse conveniente alternativa ad altri modelli di grandi dimensioni dell'occhio animali.

Introduction

Età degenerazione maculare (AMD) è la più comune causa di disabilità visiva negli adulti nei paesi industrialmente sviluppati di età compresa tra 50 anni o più, in quanto provoca la perdita della visione centrale. Circa il 15% di questi pazienti soffrono la forma "umida" della malattia, in cui neovascolarizzazione nasce dalla coroide e disturba la funzione della retina 1. Questa variante può essere trattata con una terapia altamente efficace con ripetute iniezioni intra-vitreali di farmaci antiangiogenici 2. Tuttavia, la grande maggioranza dei pazienti (~ 85%) soffrono la forma secca, che è caratterizzata da depositi extracellulari (ad esempio, drusen) sotto dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Questi depositi causare disfunzione RPE che porta alla atrofia della retina nella macula. Data la mancanza di opzioni terapeutiche curative, AMD si è evoluta in un campo di ricerca intensiva in via di sviluppo, dove sono in fase di sperimentazione molti approcci terapeutici curative diverse. la sostituzione chirurgica è RPEuna interessante possibilità di futuro per sconfiggere questa malattia debilitante 3.

Il trapianto autologo RPE sottoretinico sostituisce RPE disfunzionali o perso in macula, e ha il potenziale per ripristinare la sua funzione fisiologica 4-9. Questa tecnica chirurgica ha avuto una svolta con lo sviluppo di protocolli di differenziazione RPE da cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC), dando lo scienziato una fonte di cellule illimitata di RPE per il trapianto 10. RPE trapianto è ormai riconosciuto come un interessante primo-in-umana domanda di terapie con cellule staminali derivate. L'occhio offre un ottimo accesso chirurgico e sofisticati strumenti di monitoraggio vivo 11-13.

Per trapiantare l'RPE, un modo è con una consegna minimamente invasiva mediante una sospensione cellulare, in alternativa, per preservare meglio le caratteristiche e la funzione RPE trapianto, arti fi ciale vettore substrAtes (ponteggi) per la sostituzione RPE vengono presi in considerazione 4,14,15. Modelli animali di grandi dimensioni sono necessari per la validazione preclinica, ma informazioni tecniche dettagliate sulla gestione degli animali e la tecnica chirurgica manca ad oggi 16-23.

Noi e altri 11,24 nonostante qualche prova contraria 25, consiglia l'uso di un substrato portante ma elastico rigido in quanto fornisce una movimentazione più sicura, preserva l'integrità monostrato e funzionalità. Nel corso del tempo abbiamo testato diversi strumenti progettati su misura e le tecniche accessorie per l'impianto di cellule-carrier trapianti RPE supportati nello spazio sottoretinico (SRS). Abbiamo utilizzato le registrazioni video intraoperatorie, in vivo ophthalmoscopy scansione laser in combinazione con il dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SLO / SD-OCT), e l'istologia per valutare il successo dell'impianto 14,26,27. Qui forniamo la nostra raccomandazione corrente per subretiniche impianti RPE nei conigli,che sono stati testati in 5 diversi ceppi di coniglio, 7 materiali di supporto cella e fonti di cellule RPE 4 in più di 150 procedure.

Protocol

L'etica di movimentazione di animali nella ricerca oftalmica: Abbiamo ottenuto l'approvazione da parte del Comitato Etico della Facoltà di Medicina, Università di Bonn, e aderiscono alle linee guida indicate dalla Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO). Inoltre, tutte le procedure sono state approvate dalle autorità di regolamentazione stato del Nord Reno-Westfalia. Gli animali sono stati tenuti al chiuso in una struttura specializzata in una stanza con aria condizionata, con temperature tra i 18 – 20 ° C, l'esposizione alla luce del giorno normale, in gabbie individuali standardizzati, con libero accesso a cibo e acqua. Nota: per garantire gli animali affinità operative, una scheda di valutazione della salute degli animali è seguita, che comprende i seguenti animali definitiva criteri di esclusione: il 20% di perdita di peso rispetto al peso del ricovero; apparente cianosi dell'animale; brividi animali, ha crampi o non può muoversi in coordinamento; . atassia / parestesia, ad esempio, paralizza; apatia; mutilazione estrema automatico (ferite della pelle, membra mozzate). </ P> 1. Sterilizzazione Instrument Mettere strumenti riutilizzabili in bagno a ultrasuoni. Aggiungere 500 ml di acqua distillata e 2 ml di strumento disinfettante. strumenti Pulire utilizzando la funzione di scansione per 15 min. Rimuovere gli strumenti da bagno ad ultrasuoni e risciacquare abbondantemente con acqua distillata per 5 minuti. Inserire gli strumenti in autoclave e utilizzare il programma standard (sterilizzazione degli strumenti sotto 121 ° C per 20 minuti). 2. Strumento Preparazione Stabilire e mantenere un campo sterile, lavorando in una stanza chiusa, indossando scrub chirurgico, maschera e la copertura dei capelli. Disinfettare le mani prima di indossare guanti chirurgici sterili. Per approccio dettagliato vedi 28. Mettere strumenti sterilizzati su un telino sterile. Mettere 1 ml siringa riempita con 40 mg di triamcinolone collegato a un ago 27 G per l'iniezione, siringa da 10 ml con una soluzione di bilanciamento del sale (BSS), e siringa da 5 ml of lubrificante sul telo. Mettere 3-0 seta, 7-0 Vicryl, bastoni oculari (per fermare l'emorragia congiuntivale / sclerale), spugne twister garza, strisce di chiusura della ferita (per fissare il tubo punta vitrectomia), e il filo in fibra lampadario endoillumination su un drappo. Scartare 25 G lampadario endoilluminator e connettersi a macchina luce utilizzando tecniche sterili (vedi punto 2.1). Collegare insieme vitrectomia compreso vitrector ad alta velocità e Venturi cassette di macchina vitrectomia utilizzando tecniche sterili (vedi punto 2.1). Open 500 ml flacone BSS e connettersi soluzione di Venturi cassetta secondo le istruzioni del produttore. 3. Preparazione di anestesia e Posizionamento del Animal Pesare animale per garantire accurate dosaggio del farmaco. Preparare l'anestesia per via intramuscolare (IM) con 1 siringa con 27 ago G contenente 0,35 mg / kg di ketamina e 0,25 mg / kg medetomidina per l'avviamento. Capovolgere la siringa per mescolare. Preparare 2 siringhe con 1/3 tsi dosa per mantenere l'anestesia durante l'operazione. Preparare siringa contenente 20 ml di soluzione di glucosio 5% e 18 G ago per iniezione sottocutanea in alternativa infusione endovenosa. Dare 3 x 1 goccia di occhio mydriatic si interrompe prima di vitrectomia per allievo dilatazione. coniglio copertina con una coperta per calmare prima dell'iniezione anestesia, iniettare nel dell'arto posteriore (muscolo del gluteo) e massaggio intorno al sito di iniezione per 30 sec. Nota: Il primo colpo di IM anestesia dura circa 1-2 ore. a seconda delle dimensioni del coniglio, tolleranza al farmaco, strato di grasso, stress e la temperatura corporea. Il primo segno di anestesia svanire è un nistagmo (deve essere monitorato dal chirurgo), iniezioni successive durano circa 30 – 45 min. Verificare il corretto anestesia, verificando l'ipnosi, iporeflessia, analgesia e rilassamento muscolare dell'animale. Dare iniezione sottocutanea (Pt. 3.3) nella pelle del collo piega, una volta che il coniglio è inconscia. Aggiungere methylclubrificante ellulose ogni 5 – 10 minuti a occhio operato, aggiungere lubrificante e nastro coperchi nell'occhio non operati. Posizionare il coniglio coperto sul tavolo operatorio drappeggiato con una coperta come una coperta di cotone in una posizione ottimale (naso leggermente elevata attraverso uno stampo della coperta, in modo che sia a livello con la superficie oculare) sotto microscopio chirurgico. Allineare occhio perpendicolare al microscopio obiettivo. Garantire la corretta temperatura corporea utilizzando termometro rettale (normotermia 39 ± 1 ° C) 29. ciglia tagliato con le forbici (un unguento sulla lama) per ridurre le infezioni post-operatorie. Disinfettare l'occhio con 2 – 3 gocce di 0,1 g / ml iodopovidone topica per 1 min e risciacquare con sterili BSS. Coprire gli occhi con garza sterile con apertura pre-tagliati a metà per l'occhio e poi coprire con (appiccicoso) incisione chirurgica drappo 12 x 17 cm. 4. Vitrectomia Proptose e occhio sicuro con 3-0 seta con invpinza erted e, eseguire una peritomy congiuntivale. Incidere la congiuntiva con una forbice Vannas vicino al limbo, ma abbastanza lontano dai vasi sanguigni (~ 1 mm di distanza). Sezionare congiuntiva creando un "T-cut". Prima ingrandire la peritomy con la forbice parallelo limbus e poi incidere la congiuntiva verticalmente in forma di "T" per circa 6 – 7 mm. separare con cautela la congiuntiva senza mezzi termini. Eseguire un sclerotomie con una lama di 23 G microvitreoretinal (MVR) alle ore 8 su occhio destro / OD (04:00 su occhio sinistro / OS) inserendo con attenzione la punta affilata della lama nella direzione verso il nervo ottico. Lentamente ritirare la lama nella stessa direzione ed evitare allargando il sclerotomie. Inserire e laterale sutura personalizzato porta-infusione cannula 27 con sutura 7-0 seta e impostare la pressione intraoculare (IOP) a 24 mmHg. Eseguire un sclerotomie con 25 G testa piana trequarti a ore 2 in OD (10 o '; Orologio su OS) simile al punto 4.2. Inserire 25 G luce lampadario in piatta trequarti testa, fissare con nastro adesivo e accendere la sorgente luminosa a circa il 30%. Se necessario, rimuovere edematosa epitelio corneale utilizzando un bisturi # 20 per una migliore visualizzazione intraoculare. Eseguire un sclerotomie simile al punto 4.2 alle ore 10 su OD (ore 2 su OS), (pre) posto-u forma di 7-0 punti di sutura intorno sclerotomie senza legare il nodo e inserire vitrectomia taglierina punta. Inizia vitrectomia 30 intorno al porto di entrata, per poi proseguire il disco ottico e le medullares Fibrae utilizzando vitrector ad alta velocità di taglio del vitreo in piccoli pezzi a max. 2.000 – 3.000 tagli / min, aspiranti a max. 200 mmHg tramite Impostazione del parametro indicato della macchina vitrectomia (Tabella 1) Eseguire un distacco del vitreo posteriore (PVD) separando vitreo dalla retina tenendo il vitrector ad alta velocità su un palo posterioreND (se possibile con delicatezza) superiore del disco 31, mentre l'aspirazione solo a max. 200 mmHg senza taglio. Iniettare circa 50 ml (20 mg) o triamcinolone fluoresceina diluito (circa 0,1 mg / ml) per via intravitreale di visualizzare e facilitare (quasi totale) rimozione del vitreo galleggiante sopra il polo posteriore e circonferenza media durante la vitrectomia. Evitare attraversando sotto la lente. Rientro a radersi vitreo periferico da un assistente (qualificati) è raccomandato se tamponamento gas è desiderato. Aggiungere 20 unità / ml di eparina e 0,5 mg epinefrina alla concentrazione finale di 0,001 mg / ml nella soluzione per infusione BSS in parallelo o dopo passo 4.10. Nota: Come eparina / epinefrina non vengono iniettati intraoculare i loro effetti sono ritardati a seconda della portata di infusione. 5. Caricamento Shooter Nota: Il lavoro qui descritto non rientra tra i principi della Dichiarazione di Helsinki; essa non ha coinvolto pazienti umani. Qui, STAcellule ndard RPE sono stati isolati da occhi umani fetali, coltivate e differenziate sulla non rivestito in poliestere da 10 micron di spessore (PET) inserisce secondo il nostro protocollo precedentemente pubblicato 14. Un permesso di lavorare con il materiale fetale umano è stato ottenuto dal comitato etico dell'Università di Bonn. In alternativa, HES-RPE sono stati spediti dal laboratorio Skottman (manoscritto in preparazione.), Dove sono stati coltivati ​​secondo la tecnica descritta da Vaajasaari et al 32.; per queste cellule un permesso è stato ottenuto dalla R. Koch Institute, Berlino, Germania. Risciacquare coltura cellulare prima della preparazione del 3x dell'impianto con BSS grado oftalmica. Riempire un piatto di coltura cellulare standard (100 x 20 mm) con 10 ml oftalmica BSS grado. Aggiungere l'inserto di coltura cellulare in BSS e centrare il piatto sotto un microscopio ottico. Punch un impianto di 2,4 x 1,1 mm con, di forma ovale, ago misura smussato per ottenere un substrato piatta, a forma di fagiolocon due bordi lunghi e due bordi arrotondati. Inondare delicatamente l'ago attraverso la seconda porta con BSS per scovare l'impianto nel BSS riempita stazione di carico su misura (Figura 1). Opzionalmente tagliare una estremità rotonda di impianto (<0,5 mm), solo per ottenere un terzo bordo. Assicurarsi che l'impianto è nel giusto orientamento facendo in modo che il monostrato è a testa sul supporto cellulare. Per modificare il posizionamento usare con cautela due bisturi. Premere delicatamente l'impianto e completamente nello strumento shooter usando il supporto dell'ago finché tutte le protesi è fissata all'interno della punta. Il pistone deve rimanere retratto. Mantenere il "caricato" punta sparatutto in stazione di carico sotto BSS fino al momento dell'impianto. 6. impianto Approccio retina neurale con estensibile 41 G ago per iniezione sottoretinico collegato ad una siringa a tenuta di gas (garantire che tutte le bolle d'aria sono stati evacuatida tubo!). Iniettare BSS (con calcio e magnesio / CM) subretinally e, quindi, creare una bozza distacco di retina (BRD) di circa 2 – 3 diametro del disco (DD). Due BRD per occhio può essere sollevato in modo sicuro. Ingrandisci retinotomia a 1,5 mm con verticali 23 G VR-forbici. Lo spazio sottoretinico è ora accessibile per l'impianto o ulteriori manovre. Estensione sclerotomie (appunto) con un coltello un'incisione 1,4 millimetri a 20 approccio G. Tentativo passando attraverso la sclerotomie utilizzando un 20 G tiratore manichino, ingrandire come necessario per garantire il buon, la transizione eppure avvolgente del tiratore caricato. Passare con il tiratore caricato 27 attraverso sclerotomie idealmente a 24 mmHg. Approccio retinotomia bordo ed espellere l'impianto subretinally da una posizione epiretinal. Regolare l'impianto con semichiusi 23 g forbici, pinza o 41 ago G per assicurarsi che sia posizionato bene sotto il retina- ragionevolmente lontano dal retinotomia. 7.Fine Operazione Rimuovere 25 lampadario G e l'infusione cannula. Suturare tutte sclerotomie. Iniettare 25 ml (10 mg) triamcinolone dal sclerotomie ore 8 (prima di sutura scorso sclerotomie). Controllare / regolare IOP con la palpazione e iniettare BSS via 30 ago G / siringa, se necessario. congiuntiva Sutura con 7-0 Vicryl. Rimuovere proptosing 3-0 seta imbracatura lentamente (Evitare profondo del plesso venoso orbitale!). Aggiungere desametasone / pomata antibiotica sotto coperchio. Posizione per 1 ora coperto con coperta con occhio operato rivolto verso l'alto (w / o gas), o verso il basso (con aria / gas). Non lasciare animali incustoditi fino a quando non riprende conoscenza sufficiente per mantenere prona sternale. Non trasportare il coniglio prima che l'anestesia svanisce completamente, questo può essere accelerata iniettando medetomidina agente pari inversione ammontare di medetomidina dato. 8. Post-operatorio cura degli animali Tenereconigli in condizioni adeguate (temperatura, luce, cibo, acqua, spazio, ecc.) e un attento monitoraggio in una struttura specializzata. Assicurarsi che animale è ben riposato, vale a dire., Non lunghi periodi di cibo o di privazione di acqua. Cercare eventuali ferite o lesioni, in particolare sui siti di iniezione. Mantenere ferite secco per prevenire le infezioni. Dare antibiotici quando si sospetta un'infezione: desametasone 1 mg / g, neomicina solfato di 3.500 UI / g, polimixina B solfato di 6.000 UI / g unguento è stato applicato due volte al giorno per 1 settimana postoperatoria sulla superficie oculare. Aggiungere desametasone / pomata antibiotica per il prossimo 7 giorni post-operatoria due volte al giorno per una migliore rigenerazione della superficie oculare e la riduzione del dolore post-operatorio. Dare analgesici sistemici (Carprofene 4 mg / kg due volte al giorno) per 48 ore prima. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere prona sternale. Non restituire un animale cheha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non esporre gli animali a inutili sofferenze. 9. SLO / SD-OCT Guidance Preparare e iniettare per via intramuscolare anestesia (IM) con 1 siringa con 27 ago G contenente 0,175 mg / kg di ketamina e 0,125 mg / kg medetomidina per l'avviamento. Capovolgere la siringa per mescolare. Aggiungere un lubrificante almeno ogni 5 minuti per idratare l'occhio e mantenere chiara SD-OCT immagini, opzionalmente una lente a contatto personalizzato può essere utilizzato. Attaccare una piattaforma in acciaio al poggiatesta per stabilizzare l'animale nella posizione desiderata. Mettere coniglio su piattaforma d'acciaio, ponendo il suo occhio perpendicolare alla sonda. Tenere la testa del coniglio dall'osso guancia inferiore (mandibola) evitando la trachea. inclinare la testa dell'animale di circa 45 ° verso il SD OCT-sonda per ottimizzare l'angolo di visualizzazione sull'impianto. Utilizzare una lente di 30 gradi ed i seguenti parametri per optIMAL ottobre di imaging [HS]: 30 impostazioni gradi per singola linea esegue la scansione con la modalità ART impostato a 100 (media) e 20 x 20 impostazioni di laurea per le scansioni del volume con modalità ART impostato su 15; Modalità alta risoluzione non è necessaria. Utilizzare SLO immagini riflettanza all'infrarosso per trovare il piano focale dell'impianto (Fig. 2a); messa a fuoco ottimale si raggiunge quando (tutti) i bordi di impianto sono taglienti 14. Aggiungere desametasone 1 mg / g, neomicina solfato di 3.500 UI / g, polimixina B solfato 6.000 UI / g pomata sotto il coperchio al termine.

Representative Results

I risultati del metodo descritto per l'impianto sottoretinico sono riportati nella tabella 2. Attecchimento sotto la retina ha avuto un tasso di successo di circa il 61% quando è stata effettuata una vitrectomia core e rosa fino al 76%, quando distacco del vitreo posteriore è stata indotta. Questi numeri comprendono circa il 21% degli animali morti o intraoperatoria o nei primi 3 giorni dopo l'intervento. Questa tecnica può essere utilizzata per impiantare due scaffold sulle diverse aree retiniche in un occhio simultaneamente. I conigli sono stati sottoposti postoperatoria in vivo follow up usando SD-OCT ed elaborazione istologica come descritto da Stanzel et al. 27 (Figura 2). Fig. Scansione oftalmoscopio laser immagine riflettanza infrarossa impiantato RPE coltivati ​​su una membrana di poliestere (PET) 2A mostra dopo trapianto semplice. Ilalone intorno dell'impianto corrisponde a fotorecettori atrofia. Fig. 2B mostra corrispondente assottigliamento SD-OCT, avviso della retina, lo strato nucleare soprattutto esterno (ONL), banda riflettente iper su SD-OCT sopra impianto, mentre la retina neurale adiacente all'impianto mostra quasi normali bande di riflessione. Questi risultati suggeriscono una consegna atraumatica. Fig. 2C mostra Hematoxiline / eosina (H / E) macchia dell'impianto che mostra cicatrici sottoretinico e atrofia ONL intorno al sito retinotomia probabilmente come risultato della manipolazione iatrogena, uno strato pigmentato ancora irregolare contigui su PET. membrana di Bruch sotto l'impianto sembrava essere contigui, e il choriocapillaris contiene alcuni eritrociti sparse. Questi risultati morfologica sono paragonabili alla SD-OCT e rafforzare la tesi di una consegna atraumatica. Figura ure 1: Caricamento Shooter con umana iPSC-RPE coltivati ​​su PET cellulare Carrier. A) mostra punzonatura fuori un impianto con ago su misura. B) impianto a forma di fagiolo tagliato da colture cellulari. C) Posizionamento dell'impianto prima del carico. D) Carico di sparatutto con protesi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura . Figura 2: coltivate umana HES-RPE su Pet Carrier cellulare 4 settimane in Coniglio sottoretinico spazio. A) immagine riflettanza infrarossa SLO Spettacoli, linea verde delimita la sezione trasversale di fig. 2B. B) corrispondente SD-OCT. C) H / E macchia, vedi testo o 26,27 per i dettagli.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Parametro impostazioni usate vitrectomia 6.000 tagli / min Vuoto 200 mmHg Ora di alzarsi 1 secondo Aria 24 mmHg Irrigazione 24 cmH2O DIATHErmy 30% Tabella 1: Impostazione dei parametri del Vitrectomia macchina. vitrectomia Impiantare conigli azionati l'impianto di successo l'impianto non riuscito Morte Tasso di successo% vitrectomia core ANIMALE DOMESTICO 30 19 4 7 63.33 PET + RPE 70 42 12 16 60 PVD, ± plasmina w / PPV ANIMALE DOMESTICO 28 21 2 5 75 PET + RPE 22 17 2 3 77.27 Tabella 2: Riassunto delle ultime 150 operazioni tra cui il metodo e l'impianto tipo.

Discussion

Utilizzando un modello di coniglio, un metodo sicuro e riproducibile è presentato per la consegna transvitreal di RPE coltivati ​​su vettori cellulari nello spazio sottoretinico con uno strumento tiratore custom-designed. Il metodo descritto offre una breve tecnica chirurgica / ottimizzati per l'apprendimento facile, in quanto si tratta di tecniche standard di vitrectomia con manovre subretiniche. Esito è notevolmente facilitato da una interfaccia vitreoretinica pulita, e l'infusione intraoculare che evita la turbolenza del liquido sul sito di impianto, inducendo vescichetta distacco di retina (BRD) a bassa IOP, prevenendo retina e danni sclera attraverso la secchezza, e appropriato posizionamento del coniglio.

Si avverte tuttavia, come diverse complicazioni intra-operatorie può verificarsi in qualsiasi momento, ostacolando il successo l'impianto, ad esempio intra emorragie oculari, anestesia dissolvenza fuori durante fasi vitali come l'impianto, collasso della BRD causa della manipolazione strumento o ipotonia oculare, RAbbit morte a causa di dosi eccessive di anestesia, la pressione sanguigna bassa durante il funzionamento a lungo che causano danni al cervello ipossia, o ipertermia. Eppure queste complicazioni diminuiscono con il tempo in quanto sono rapidamente affrontati e risolti aumentando l'esperienza del team chirurgico.

Alcune complicazioni potrebbero essere ridotti seguendo alcune semplici ma importanti passi. Il lubrificante deve essere aggiunto ogni 5 – 10 minuti per evitare corneale, danni sclerale e congiuntivale durante l'operazione, e di mantenere un chiaro supporto intraoculari, come essiccati / sclera annerito può essere una causa di deiscenza della ferita, che a sua volta porta ad ipotonia oculare e / o perdite intraoperatoria da sclerotomie. Eparina deve essere aggiunto per impedire la formazione di una pellicola di fibrina che rende l'impianto particolarmente sottoretinico impegnativo e contemporaneamente aggiungendo epinefrina per ridurre sanguinamento sotto eparina 16. tempi troppo lunghi eparina / esposizione epinefrina (> 1 ora) dovrebbero essere evitati per evitare ede cornealema da scompenso endoteliale 33, crisi ipertensive o fatalità intraoperatoria. rimozione del vitreo meticolosa deve essere eseguita a porta strumento (ingresso) per evitare retina e / o distacchi della coroide. strumenti intraoculari devono essere puntati verso polo posteriore per evitare di toccare la lente (provoca la formazione di cataratta iatrogena) o (punto di ingresso) danni alla retina. Un intraoculare side-port infusione cannula deve essere utilizzato, in quanto attenua la corrente a getto intorno alla zona di impianto, impedendo così lacerazione incontrollata del retinotomia e collasso del brd. induzione BRD sulla linea mediana (asse verticale da nervo ottico) o in prossimità di fibre ottiche midollari dovrebbero essere evitati per evitare ampi distacchi retinici iatrogeni. Infine, ultimo ma non meno importante BRD deve essere indotto a bassa IOP, per evitare l'iniezione sottoretinico BSS utilizzando portate eccessive che possono portare ad un danno retinico (ad es., Allungando).

Molte variabili di studio, come Carrie cellularer varianti, fetale, adulto o cellule staminali derivate fonti di cellule RPE, scelte per immunosoppressori, ecc., possono essere esplorati 14,26,27,34. Ulteriore miglioramento quali i metodi di coltura RPE senza siero, caratterizzazione delle xenoRPE nello spazio sottoretinico, la rimozione dello strato di RPE ospite 14 o strategie per l'ancoraggio dell'impianto sono lavori in corso in corso.

Ad oggi le tecniche descritte sono state utilizzate su 5 diversi ceppi di coniglio, tra cui cincillà bastardo, bastardo Chinchilla / ibridi KBL, Nuova Zelanda Bianco / Croce Rossa, New Zealand White (albino) e olandese cintura. Entrambi i conigli maschi e femmine sono stati operati, con i conigli almeno 1,5 kg o 2 mesi di età (a seconda della specie). La maggior parte degli interventi chirurgici erano su conigli pigmentati (cincillà bastardo o ibridi bastardi cincillà) con pesi tra 2,5-3 kg.

Tutti i ceppi di coniglio che abbiamo avuto l'opportunità di lavorare con sembrano avere alcune peculiarità. Dato glive disponibilità di conigli pigmentati del ceppo cincillà bastardo in Germania nel 2009-13, abbiamo raccolto più esperienza con questi animali. Purtroppo non è più disponibile, poiché l'allevamento è stato interrotto, ma confronta molto bene a New Zealand White / Red Cross eccezione della sclera spessa più vantaggioso e volumi occhio più grande in quest'ultimo. Chinchilla ibridi bastardi hanno una significativa formazione di fibrina intraoperatoria e richiedono l'uso di eparina / epinefrina come descritto in precedenza per garantire manovre subretiniche successo. Questo protocollo è stato eseguito in conigli albini non pigmentate (Nuova Zelanda bianchi), la creazione di tuttavia particolarmente BRD e l'impianto sottoretinico è più difficile dato ridotto apprezzamento contrasto. La fattibilità di indurre un distacco del vitreo posteriore non sembra ceppo coniglio dipendente nelle nostre mani.

consegna sottoretinico Transvitreal è probabile che la futura strategia chirurgica di scelta dato che è il più comm sul percorso oggi clinicamente per accedere alla retina. Di conseguenza molti altri gruppi hanno presentato queste tecniche per RPE coltivati ​​su carrier supporta nel lavoro animale 11,15,23,35. Aramant et al. 36 hanno uno strumento, che pone piuttosto che spinge il loro impianto morbido idrogel-incapsulato per il suo sito di destinazione sottoretinico. La progettazione di Thumann et al. Utilizza una spatola cava, che rilascia l'innesto carrier supportata da galleggiare fuori attraverso l'iniezione del fluido 19. Entrambi ex strategie richiedono l'inserimento sottoretinico dello strumento, che a nostro avviso è più incline a complicazioni, rispetto a uno strumento epiretinally appositioned. Montezuma et al. 22 ha descritto un strumento introduttore sottoretinico per la fornitura di impianti di chip subretiniche nei suini, ma nessun ulteriore lavoro è stato pubblicato in quanto al meglio delle nostre conoscenze. Siamo stati in grado di estendere la tecnica descritta con alcune modifiche al maiale.

jove_content "> I nostri vettori cellulari preferite sono 10 micron tereftalato poliestere (PET) membrane. Da un punto di vista chirurgico, questo materiale ha parametri di rigidezza ed elasticità favorevoli, oltre alla sua ampia versatilità in esperimenti di coltura cellulare. Abbiamo trovato esperienze simili con tetrafluoroetilene espanso (ePTFE) 37 o nanofibre membrane elettrofilate da PET, poli-lattico / capronolactic (PLCL) o poli -. lattico-co-glicolico acido (PLGA), nonché nanofibre composito (PLGA o PET) e ultrasottile PET 26 Quando le membrane in PET vengono utilizzati con il nostro strumento tiratore metallico, hanno una tendenza occasionale ad esporre carica elettrostatica, che sfida la loro espulsione dal tiratore 27. ultrasottili membrane poliimmide potrebbero nelle nostre mani non possono essere impiantati nello spazio sottoretinico con il protocollo descritto sopra ( manoscritto in preparazione).

Marmor et al. hanno studiato sistematicamente reso spontanearption di fluido sottoretinico in iatrogene distacchi retinici localizzate 38-41. Anche dopo la manipolazione nello spazio sottoretinico questi sono stati trovati ad essere riassorbito dal postoperatoria giorno 4 in chirurgia senza incidenti. retinopessia laser non viene eseguita per fissare i bordi del retinotomia. Anche se controintuitivo rispetto alla chirurgia umana, non è richiesto tamponamento aria / gas. Salvo rimozione meticolosa vitreo periferico può essere realizzato, soprattutto nel quadrante superiore, questo può infatti provocare rotture retiniche giganti provenienti dal sito retinotomia. Si raccomanda solo fine di eseguire il ricambio d'aria fluido con conseguente 20% tamponamento gas SF6 per salvare intraoperatori distacchi retinici iatrogeni o nel caso in cui una particolare posizione dell'impianto deve essere assicurato.

Anche se l'ablazione indotta meccanicamente della retina neurale può causare RPE e fotorecettori danni nei conigli 42,43, la sua estensione varia notevolmente (anche con regolare BSS) dein attesa su fattori quali il tipo IOP, siringa usata, volume di iniezione con retina in tal modo indotta stretching, ecc. Abbiamo anche testato il spesso consigliato Ca / Mg-libera BSS facilitato il distacco 42-44, ma ha scoperto che essa provoca opacizzazione della lente intraoperatoria (in particolare con temperatura elevata), e significativamente ritardi o addirittura ostacola retina ri-attacco 27. Si raccomanda pertanto di volume 30 ml di regolare BSS con una siringa 100 ml – iniezione lenta sottoretinico di 20; movimenti ago per l'iniezione deve essere minimo in modo che i sigilli retinotomia intorno ad esso e prevenire danni membrana di Bruch. Alcuni dei danni iatrogeni può essere risolto RPE guarigione delle ferite, e la conservazione relativa osservata di spessore ONL dopo riattacco, suggerisce che il complesso / fotorecettore RPE può tollerare questa perdita di valore, come anche descritto da altri 45.

terapie basate sulle cellule o protesi retiniche richiedono anima preclinical test prima di approvazione di regolamentazione e di iniziare gli studi di sicurezza umana. L'ex variano da paese a paese. Il modello di coniglio qui descritto può servire come una piattaforma conveniente e meno impegnativo per stabilire o anche di effettuare tutti i requisiti da parte delle autorità di regolamentazione. Inoltre, esso può successivamente servire per la formazione di chirurghi in eventuali studi clinici multicentrici o ulteriori miglioramenti della tecnica lungo il percorso.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sostenuta da sovvenzioni Rüdiger Fondazione nel 2008 e 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Borsa di studio O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Borsa di studio O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, cinese borsa di studio del Consiglio n 2008627116 (ZL) e una sovvenzione illimitata da Geuder AG, Heidelberg (Fig. 2). I membri del laboratorio di H. Skottman, Università di Tampere in Finlandia Si ringraziano per la fornitura di hES derivati ​​RPE mostrato in figura 2.

Materials

s30 ultrasonic cleaning unit Elmasonic 100 4631 2.75L
DE-23  autoclave Systec C 2209 23L
Syringe  BD  300013
300995 
301285
300294
300330 		 1ml x3
2ml x3
5ml x1
10ml x1
20ml x1
Needle  BD 305196
305136		 18G x 1 
27G x5
Scalpel Feather 2975#20 blade#20 x3
Surgical drape HARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER		 277 502
25 440		 60×40 cm x2
12×17 cm
Ocular sticks LOHMANN & RAUSCHER 16 516 66×5 mm
Twister gauze sponges HARTMANN 481 274 x2
Closure strips HARTMANN 540 686 x4
Opmi Visu CS Microscope Zeiss N/a incl. fundus imaging system BIOM II
Chandelier endoillumination Geuder G-S03503 +
G-S03504		 25G incl. trocar
Light machine Geuder G-26033 Xenotron III
Vitrectomy machine Geuder G-60000 MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector Geuder G-46301 MACH2 vitreous cutter 23G
Venturi cassette  Geuder G-60700
Sideport-infusion cannula Geuder custom  1x23G
3-0 silk suture ETHICON V546G x1
Caliper Geuder G-19135 x2
Vannas scissors Geuder G-19777 x1
Sclerotomie blade Ziemer 21-2301 1x23G
1x20G
7-0 silk suture ETHICON EH6162H x1
Needle holder Geuder G-32320 x2
Iris forceps Geuder G-18910 x1
Colibri forceps Geuder G-18950 x1
Extendible subretinal injection needle DORC 1270.EXT 41G
VR scissor Geuder G-36542 25G
Grieshaber forceps holder Alcon 712.00.41 23G
Curved scissor forceps tips Alcon 723.52 23G
Implant loading station Dow Corning 3097358-1004 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
blunt oval implant trephine  Geuder custom-made  2.4 x 1.1 mm 
Shooter dummy Geuder G-32227 x1
Shooter Geuder G-S03443 x1
Flute needle DORC 1281.SD 20G (Vacuum)
Manual microliter syringe Hamilton 24535 100µl
Tissue culture plates Greiner bio-one  664160 100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
Imaging System		 Heidelberg
工学		 N/a Spectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
Name Company Active agent コメント
Mucadont-IS Merz Hygiene virucidal instrument disinfectant  2L
Mucocit T Merz Hygiene Aldehyde-free instrument disinfectant 2L
Ketamin 10% WDT Ketamine  10ml (100mg/ml)
Domitor Orion Pharma Medetomidine hydrochloride 10ml (1mg/ml)
Antisedan Orion Pharma Atipamezole hydrochloride 10ml (5mg/ml)
Neosynephrin POS 10% URSAPHARM Phenylephrine HCl 10ml
Mydriacyl Alcon Tropicamid 10ml (5mg/ml)
Methocel 2% Omni Vision hydroxypropyl methylcellulose 10g
PURI CLEAR ZEISS Balance salt solution (BSS)  500ml
Glucose 5%   B.Braun Glucose 5%  solution 100ml
Heparin-Natrium-25 000 Ratiopharm Heparin 5ml (2500 unit/ml)
Suprarenin SANOFI Epinephrine 1ml (1mg/ml)
Triamcinolone University of Bonn pharmacy preservative-free Triamcinolone  1ml (40mg/ml) 
Isoptomax eye ointment Alcon dexamethasone 1 mg/g
neomycin sulfate 3,500 IU/g
polymyxin B sulfate 6,000 IU/g		 10ml
Betaisodona Mundipharma Povidon-Iod 30ml (1g/10ml)
Optive ALLERGAN sodium carboxymethylcellulose glycerol 10ml
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Fine, A. M., et al. Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula. Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).
  2. Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 379, 1728-1738 (2012).
  3. Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches. Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).
  4. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).
  5. da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).
  6. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch’s membrane and the human macula. Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).
  7. Gouras, P., Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. . The retinal pigment epithelium. , 492-507 (1998).
  8. Lund, R. D., et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).
  9. Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies. Regen Med. 7, 32-39 (2012).
  10. Hirami, Y., et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).
  11. Carr, A. J., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).
  12. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385, 509-516 (2015).
  13. Jha, B. S., Bharti, K. Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue. Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).
  14. Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).
  15. Hynes, S. R., Lavik, E. B. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).
  16. Szurman, P., et al. Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits. Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).
  17. Bhatt, N. S., et al. Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).
  18. Nicolini, J., et al. The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation. Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).
  19. Thumann, G., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 30, 287-294 (2009).
  20. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).
  21. Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes. Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).
  22. Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  23. Brantfernandes, R. A., et al. Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312 (2012).
  24. Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).
  25. Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).
  26. Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography. Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).
  27. Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).
  28. AORN Recommended Practices Committee. Recommended practices for maintaining a sterile field. AORN J. 83 (2), 402 (2006).
  29. Hong, S. B., et al. Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits. Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).
  30. Machemer, R. The development of pars plana vitrectomy: a personal account. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).
  31. Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet’s channel and a novel structure, the ‘alae canalis Cloqueti’. Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).
  32. Vaajasaari, H., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  33. Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy. Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).
  34. Thieltges, F., et al. Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824 (2015).
  35. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).
  36. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).
  37. Stanzel, B. V., et al. SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch’s Membrane Prosthetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241 (2010).
  38. Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).
  39. Frambach, D. A., Marmor, M. F. The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).
  40. Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).
  41. Marmor, M. F. Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies. Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).
  42. Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).
  43. Szurman, P., et al. Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).
  44. Fang, X. Y., et al. Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits. Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).
  45. Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).

タグ

Subretinal SurgeryRabbit ModelRPE ReplacementAge-related Macular DegenerationCell-based TherapyVitrectomyIntraocular SurgeryAnesthesiaDisinfectionProptosisConjunctival PeritomyMicrovitreoretinal BladeScleral Incision

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Al-Nawaiseh, S., Thieltges, F., Liu, Z., Strack, C., Brinken, R., Braun, N., Wolschendorf, M., Maminishkis, A., Eter, N., Stanzel, B. V. A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits. J. Vis. Exp. (115), e53927, doi:10.3791/53927 (2016).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image