A l'étape par le protocole de l'étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

L'éthique de la manipulation des animaux dans la recherche ophtalmique: Nous avons obtenu l'approbation du comité d'éthique de la Faculté de médecine, Université de Bonn, et adhèrent aux lignes directrices énoncées par l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO). En outre, toutes les procédures ont été approuvées par les autorités réglementaires de l'Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie. Les animaux ont eu lieu à l'intérieur dans un établissement spécialisé dans une salle climatisée avec des températures entre 18 – 20 ° C, l'exposition à la lumière du jour régulière, dans des cages individuelles normalisées avec accès libre à la nourriture et de l'eau. Remarque: Pour assurer les animaux d'affinité opératoire, une feuille de pointage de la santé animale est suivi qui comprend les animaux définitive des critères d'exclusion suivants: 20% de perte de poids par rapport à un poids à l'admission; cyanose apparente de l'animal; frissons d'animaux, a des crampes ou ne peut pas se déplacer dans la coordination; . ataxie / paresthésie, par exemple, paralysies; apathie; mutilation extrême auto (des plaies de la peau, des membres sectionnés). </ P> 1. Instrument de stérilisation Placez les instruments réutilisables dans un bain à ultrasons. Ajouter 500 ml d'eau distillée et 2 ml de désinfectant pour instruments. Nettoyer les instruments à l'aide de la fonction de balayage pendant 15 min. Retirer les instruments du bain à ultrasons et rincer abondamment à l'eau distillée pendant 5 min. Insérez instruments en autoclave et utiliser le programme standard (stérilisation des instruments sous 121 ° C pendant 20 min). 2. Instrument de préparation Établir et maintenir un champ stérile, en travaillant dans une pièce fermée, le port chirurgical frotte, masque et couverture de cheveux. Désinfecter les mains avant de porter des gants chirurgicaux stériles. Pour l' approche détaillée , voir 28. Placez les instruments stérilisés sur un champ stérile. Placer 1 ml d'une seringue préremplie de 40 mg triamcinolone attachée à une aiguille 27 G pour injection, une seringue de 10 ml avec une solution saline équilibrée (BSS) et une seringue de 5 ml of lubrifiant sur le champ opératoire. Placez soie 3-0, 7-0 Vicryl, bâtonnets oculaires (pour arrêter le saignement conjonctival / scléral), éponges twister de gaze, bandes de fermeture de plaies (pour fixer la pointe des tubes de vitrectomie) et lustre endoillumination fil de fibre sur un drap. Déballer 25 G lustre endoilluminator et se connecter à la machine de lumière en utilisant des techniques stériles (voir étape 2.1). Se connecter ensemble de vitrectomie y compris vitréotome haute vitesse et la cassette Venturi à la machine de vitrectomie en utilisant des techniques stériles (voir étape 2.1). Ouvrez 500 ml BSS bouteille et connecter la solution à la cassette Venturi selon les instructions du fabricant. 3. Préparation d'anesthésie et de positionnement de l'animal Peser animal pour assurer un dosage de médicament précis. Préparer intramusculaire (IM) en utilisant l'anesthésie 1 seringue avec 27 aiguille G contenant 0,35 mg / kg de kétamine et 0,25 mg / kg médétomidine pour le démarrage. Retournez la seringue pour mélanger. Préparer 2 seringues avec 1/3 til doses pour maintenir l'anesthésie pendant l'opération. Préparer une seringue contenant 20 ml de solution de glucose à 5% et 18 aiguille G pour injection sous-cutanée sous forme d'infusion intraveineuse de remplacement. Donne 3 x 1 goutte de collyres mydriatiques avant vitrectomie pour la dilatation des pupilles. Couverture de lapin avec une couverture au calme avant l'injection d'anesthésie, injecter dans le membre postérieur (fessière musculaire) et massage autour du site d'injection pendant 30 secondes. Note: Le premier coup de IM l'anesthésie dure environ 1 – 2 h. selon la taille de l'lapin, la tolérance au médicament, la couche de graisse, le stress et la température corporelle. Le premier signe de l'anesthésie évanouissement est un nystagmus (doit être surveillée par le chirurgien), les injections suivantes durent environ 30 – 45 min. Confirmer l'anesthésie appropriée, en vérifiant l'hypnose, hyporéflexie, l'analgésie et la relaxation des muscles de l'animal. Donner une injection sous-cutanée (Pt. 3.3) dans le pli de la peau du cou, une fois que le lapin est inconscient. Ajouter methylclubrifiant ellulose tous les 5 – 10 min dans l'oeil opéré, ajouter du lubrifiant et de bande couvercles dans l'œil non opéré. Placez le lapin couvert sur la table chirurgicale drapé d'une couverture comme une couverture de coton dans une position optimale (nez légèrement élevée à travers un moule de la couverture, de sorte qu'il est de niveau avec la surface oculaire) sous microscope chirurgical. Alignez oeil perpendiculaire au microscope objectif. Veiller à la bonne température centrale du corps à l' aide d'un thermomètre rectal (normothermie 39 ± 1 ° C) 29. cils Cut avec des ciseaux (un peu de pommade sur la lame) pour réduire les infections postopératoires. Désinfectez l'œil en utilisant 2 – 3 gouttes de 0,1 g / ml Povidone-iode par voie topique pendant 1 min et rincer avec BSS stérile. Couvrir les yeux avec champ stérile avec ouverture pré-découpée au milieu de l'œil, puis couvrir avec (collant) incision chirurgicale drap 12 x 17 cm. 4. vitrectomie Proptose et oeil sécurisé avec 3-0 soie en utilisant invétrier erted et, effectuer une péritomie conjonctivale. Inciser la conjonctive avec une paire de ciseaux Vannas près de limbe, mais assez loin des vaisseaux sanguins (~ 1 mm de distance). Disséquer la conjonctive en créant un "T-cut". Tout d'abord agrandir le péritomie avec le ciseau parallèle à limbe puis inciser la conjonctive verticalement sous forme d'un "T" pour environ 6-7 mm. Séparez délicatement la conjonctive sans ménagement. Effectuer une sclérotomie en utilisant une lame 23 G microvitreoretinal (MVR) à 8 heures œil droit / OD (4 heures, oeil gauche / OS) en insérant avec précaution l'extrémité pointue de la lame dans la direction vers le nerf optique. Rétracter lentement la lame dans la même direction et à éviter l'élargissement de la sclérotomie. Insérez et côté suture personnalisé port-canule de perfusion 27 en utilisant une suture 7-0 de la soie et la pression intraoculaire set (IOP) à 24 mmHg. Effectuer une sclérotomie avec 25 G tête plate trocart à 2 heures sur OD (10 o '; Horloge sur OS) similaire à l'étape 4.2. Insérez 25 G lustre de la lumière dans la tête plate trocart, fixer avec du ruban adhésif et mettez la source de lumière à environ 30%. Si nécessaire, retirer l'épithélium cornéen oedémateux en utilisant un scalpel # 20 pour une meilleure visualisation intraoculaire. Effectuer une sclérotomie similaire à l'étape 4.2 à 10 heures OD (2 heures, OS), (pré) vitrectomie pointe de coupe lieu u en forme de 7-0 sutures autour de sclérotomie sans attacher le noeud, et insérer. Démarrez vitrectomie 30 autour du port d'entrée, puis continuer sur le disque optique et les medullares de fibrae utilisant vitréotome haute vitesse en coupant l'humeur vitrée en petits morceaux au max. 2.000 – 3.000 coupes / min, d'aspiration au max. 200 mmHg à l' aide de la configuration du paramètre déclaré de la machine de vitrectomie (tableau 1) Effectuer un détachement postérieur du vitré (PVD) en séparant l'humeur vitrée de la rétine en maintenant la vitréotome à grande vitesse sur la partie postérieure pôle and (si doucement possible) supérieure du disque 31 tout en aspirant seulement à max. 200 mmHg sans couper. Injecter environ 50 pi (20 mg) triamcinolone ou fluorescéine dilué (environ 0,1 mg / ml) par voie intravitréenne de visualiser et de faciliter (presque totale) le retrait du vitré flottant au- dessus du pôle postérieur et pendant la vitrectomie moyenne périphérie. Évitez de traverser sous la lentille. Indentation de se raser vitreux périphérique par un (homme) assistant est recommandé si tamponnade de gaz est souhaitée. Ajouter 20 unités / ml d'héparine et 0,5 mg d'épinéphrine à une concentration finale de 0,001 mg / ml dans la solution de perfusion BSS en parallèle ou après l'étape 4.10. Note: Comme l'héparine / adrénaline ne sont pas injectés intraoculaire leurs effets sont retardés en fonction du débit de perfusion. 5. Chargement Shooter Remarque: Les travaux décrits ici ne tombe pas sous les principes de la Déclaration d'Helsinki; il ne comportait pas des patients humains. Ici, stacellules ndard RPE ont été isolés à partir des yeux humains fœtaux, cultivées et différenciées sur non couché polyester de 10 um d'épaisseur (PET) insère selon notre protocole précédemment publié 14. Une autorisation de travailler avec le matériel fœtal humain a été obtenu à partir du comité d'éthique de l'Université de Bonn. Alternativement, hES-RPE ont été expédiés du laboratoire Skottman (manuscrit en préparation.), Où ils ont été cultivés selon la technique décrite par Vaajasaari et al 32. pour ces cellules une autorisation a été obtenue à partir de l'Institut Koch R., Berlin, Allemagne. Rincer la culture cellulaire avant la préparation du 3x implant avec BSS de qualité ophtalmique. Remplir une boîte de culture cellulaire standard (100 x 20 mm) avec 10 ml ophtalmique BSS de qualité. Ajouter l'insert de culture cellulaire dans le BSS et centrer le plat sous un microscope optique. Découper un implant de 2,4 x 1,1 mm avec un ovale, l'aiguille sur mesure émoussée pour obtenir un substrat plat, en forme de haricotavec deux bords longs et deux bords arrondis. Inonder délicatement l'aiguille à travers le second port avec BSS pour débusquer l'implant dans la coutume fait la station de chargement de BSS rempli (figure 1). couper éventuellement une extrémité ronde de l'implant (<0,5 mm), juste pour obtenir un troisième bord. Assurez-vous que l'implant est dans la bonne orientation en veillant à ce que la monocouche est à l'envers sur le support de cellules. Pour modifier le positionnement à utiliser avec précaution deux scalpels. Poussez doucement l'implant et complètement dans l'instrument de tir à l'aide du porte-aiguille jusqu'à ce que tout de l'implant est fixé à l'intérieur de la pointe. Le plongeur doit rester en retrait. Gardez la pointe de tir "chargé" dans la station de chargement sous BSS jusqu'à ce que le moment de l'implantation. 6. Implantation Approche rétine neurale avec prorogeable 41 G aiguille d'injection sous-rétinien reliée à une seringue étanche aux gaz (veiller à ce que toutes les bulles d'air ont été évacuésà partir de tubes!). Injecter BSS (avec le calcium et le magnésium / CM) sous-rétinienne et de créer ainsi un décollement de la rétine de bleb (BRD) d'environ 2 – 3 disques de diamètre (DD). Deux BRD par oeil peut être soulevée en toute sécurité. Agrandir rétinotomie à 1,5 mm avec verticaux 23 G VR-ciseaux. L'espace sous-rétinien est maintenant accessible pour l'implantation ou encore les manœuvres. Etendre sclérotomie (précisément) avec un couteau d'incision de 1,4 mm à 20 G approche. Tentative passant par le sclérotomie en utilisant un 20 G shooter mannequin, agrandir au besoin pour assurer une transition en douceur, mais confortable du tireur chargé. Passez avec le tireur chargé 27 à sclérotomie idéalement à 24 mmHg. Approche rétinotomie bord et éjecter l'implant sous-rétinienne d'une position epiretinal. Ajuster l'implant avec demi-fermé 23 G ciseaux, une pince ou 41 aiguille G pour vous assurer qu'il est bien placé sous le retina- raisonnablement loin de la rétinotomie. 7.Mettre fin à l'opération Retirer 25 G lustre et la canule de perfusion. Suture tous sclérotomies. Injecter 25 ul (10 mg) par le triamcinolone sclérotomie 8 heures (avant le dernier suturer sclérotomie). Contrôler / régler la PIO par palpation et injecter BSS via 30 G aiguille / seringue, si nécessaire. Suture conjonctive avec 7-0 Vicryl. Retirer proptosing 3-0 fronde de soie lentement (Évitez plexus veineux orbital profonde!). Ajouter la dexaméthasone / pommade antibiotique sous le couvercle. Position pendant 1 h couvert de couverture avec œil opéré vers le haut (w / o gaz), ou vers le bas (avec de l'air / gaz). Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne pas transporter de lapin avant l'anesthésie disparaît complètement, ce qui peut être accélérée par l'injection medetomidine l'agent d'inversion égale à la quantité de médétomidine donné. 8. Post-operative Animal Care Garderlapins dans des conditions appropriées (température, lumière, nourriture, eau, espace, etc.) et une surveillance étroite dans un établissement spécialisé. Veiller à ce que l' animal est bien reposé, ie., Pas de longues périodes de nourriture ou de privation d'eau. Recherchez les blessures ou les blessures, en particulier sur les sites d'injection. Gardez les plaies sèches pour prévenir les infections. Donner des antibiotiques en cas d'infection est suspectée: dexaméthasone 1 mg / g, sulfate de néomycine 3500 UI / g, sulfate de polymyxine B 6000 UI / g de pommade a été appliquée deux fois par jour pendant 1 semaine post-opératoire sur la surface oculaire. Ajouter la dexaméthasone / pommade antibiotique pour 7 jours postopératoires deux fois par jour pour une meilleure régénération de la surface oculaire et réduit la douleur post-opératoire. Donner des analgésiques systémiques (Carprofene 4 mg / kg deux fois par jour) pendant 48 heures initiale. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal quia subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne pas exposer les animaux à la détresse inutile. 9. SLO / SD-OCT orientation Préparer et injecter par voie intramusculaire (IM) en utilisant l'anesthésie 1 seringue avec 27 aiguille G contenant 0,175 mg / kg de kétamine et de 0,125 mg / kg médétomidine pour le démarrage. Retournez la seringue pour mélanger. Ajouter un lubrifiant au moins tous les 5 min pour hydrater les yeux et maintenir SD-OCT imagerie claire, éventuellement une lentille de contact personnalisé peut être utilisé. Fixer une plate-forme en acier à l'appui-tête pour stabiliser l'animal dans la position requise. Placez le lapin sur la plate-forme en acier, en plaçant son oeil perpendiculaire à la sonde. Tenir la tête du lapin de l'os inférieur de la joue (de mandibule) évitant la trachée. la tête de l'animal Tilt d'environ 45º vers le SD-OCT sonde pour optimiser l'angle de vision sur l'implant. Utilisez un objectif de 30 degrés et les paramètres suivants pour optimal imagerie OCT [HS]: 30 degrés paramètres pour une seule ligne numérise avec le mode ART réglé à 100 (moyenne) et 20 x 20 paramètres de degré pour les analyses de volume avec mode ART réglé sur 15; mode haute résolution est pas nécessaire. Utilisez SLO réflectance infrarouge imagerie pour trouver le plan focal de l'implant (Fig 2A.); mise au point optimale est atteinte lorsque (tous) les bords d' implants sont tranchants 14. Ajouter dexaméthasone 1 mg / g, sulfate de néomycine 3500 UI / g, sulfate de polymyxine B 6000 UI / g de pommade sous le couvercle lorsque vous avez terminé.