一种用于兔视网膜下手术分步协议

在眼科研究动物处理伦理：我们获得了来自医学院，波恩大学伦理委员会的批准，并坚持由研究协会在视觉与眼科（ARVO）规定的指导方针。此外，所有的程序是由北莱茵 – 威斯特伐利亚州监管当局的批准。动物室内举行一个专门的工厂在空调房间与18之间的温度 – 20°C，暴露在日光经常在与自由获取食物和水的标准化单独的笼子。 注意：为了确保动物手术亲和力，动物保健评分表之后，其中包括以下明确动物排除标准：20％的重量损失相比，重量入院;动物的表观发绀;动物不寒而栗，有绞痛或协调不能移动; 。共济失调/感觉异常， 如瘫痪;冷漠;极端切割汽车（皮肤伤口，断肢）。 </ P> 1.器械灭菌将可重复使用器械超声波浴。 加入500毫升蒸馏水和2ml仪器消毒剂。 使用扫描功能15分钟的清洁工具。 从超声波浴中取出仪器，用蒸馏水5分钟彻底冲洗。 插入釜仪器和使用标准程序（器具的消毒下121°C 20分钟）。 2.仪器准备建立和保持一个无菌区，在一个封闭的房间工作，戴着医用磨砂，口罩和发罩。消毒前，戴无菌手术手套的手。有关详细办法见28。 将消毒器械上无菌的悬垂性。 放置1ml注射器填充有附着到27克的针注射，将10毫升注射器余额盐溶液（BSS）40毫克曲安西龙，和5ml注射器ö悬垂˚F润滑剂。 将3-0丝线，7-0薇乔，眼棒（停止结膜/巩膜出血），捻线机海绵纱布，伤口缝合带（注视玻切尖管），以及吊灯endoillumination纤维的悬垂线。 解开地下25吊灯endoilluminator并连接到使用无菌技术，光机（见步骤2.1）。玻璃体切除术组，包括高速vitrector和卡带丘连接到使用无菌技术玻璃体切割机（见步骤2.1）。 打开500毫升BSS瓶，并根据制造商的说明连接解决方​​案，文丘里录像带。 3.动物的麻醉和定位的制备称取动物以确保准确的用药剂量。 准备用1注射器含0.35毫克/千克氯胺酮和0.25毫克/千克美托咪定为开始27克肌肉注射针（IM）麻醉。翻转注射器混合。 准备2注射器1/3Ť他的剂量以维持运转时的麻醉。 制备含有20毫升5％葡萄糖溶液和18g针皮下注射静脉输液替代注射器。 给前玻璃体切除瞳孔扩张散瞳眼的3×1滴一滴。 封面兔毛毯麻醉注射前的平静，在后肢（臀中肌）和周围按摩注射部位注射，持续30秒。 注：IM麻醉的第一枪大约持续1 – 2小时。根据兔子的大小，药物耐受性，脂肪层，压力和体温。麻醉消失的第一个迹象是眼球震颤（必须由医生进行监测），随后的注射去年30 – 45分钟。 确认适当的麻醉，通过验证催眠，反射降低，镇痛和动物的肌肉松弛。 在给颈部皮肤褶皱皮下注射（PT。3.3），一旦兔子是无意识的。 添加methylcellulose润滑剂每5 – 在操作眼10分钟，在非操作眼添加润滑剂和磁带保护盖。 放置在与盖披手术台被覆兔如在最佳位置上的棉毡（鼻通过毛毯的模具中稍微升高，因此它是与眼表面能级）手术显微镜下。眼睛对准垂直于显微镜物镜。 用直肠体温计（常温39±1℃）29确保适当的身体核心温度。 用剪刀（在刀片一些药膏）剪切睫毛，以减少术后感染。 消毒用2-眼 – 3滴为0.1g / ml的聚维酮碘的局部为1分钟，并用无菌的BSS冲洗。 盖眼在中间的眼睛预切割开无菌的悬垂性，然后用（粘）手术切口悬垂12×17厘米盖。 4.玻璃体切割术 Proptose安全眼用INV 3-0丝线erted卡尺，进行结膜peritomy。 切割用剪刀vannas接近角膜缘，但远远不够从血管（约1毫米的距离）结膜。 通过创建一个“T切割”解剖结膜。一是扩大平行剪的peritomy到了limbus然后垂直切开结膜在“T”形式约6 – 6毫米。小心地将结膜直言分开。 在对右眼/ OD（4点钟左眼/ OS）8时许迈向视神经小心插入刀片的尖端方向进行使用23政microvitreoretinal（MVR）刀片巩膜。慢慢缩回在同一方向的叶片，并避免扩大巩膜。 插入，并使用缝合定制侧端口浸液套管27 7-0缝合丝线和设置眼内压（IOP）在24毫米汞柱。 凌晨2点OD（10点进行了25微克平头套管针巩膜;时钟操作系统）与步骤4.2。 插入地下25吊灯光线进入平头套管针，用胶带固定，并在约 30％的打开光源。 如果需要的话，用＃20解剖刀更好眼可视除去水肿角膜上皮。 执行一个类似在巩膜上OD 10点（凌晨2时OS），（预）处的U形各地巩膜缝线7-0不绑结，并插入玻璃体切割器顶端步骤4.2。 玻璃体切割开始围绕30入境口岸，然后继续在视盘和切割玻璃体切成小块在最大使用高速vitrector的fibrae medullares。 2000 – 3000切/分钟，在最大吸气。 200毫米汞柱使用玻璃体切割机的所述参数设置（ 见表1） 通过保持高速vitrector在后极一个执行通过分离从视网膜玻璃体一个玻璃体后脱离（PVD）次（如果可行的话轻轻地）高级光盘，而只有在最大吸31。 200毫米汞柱无切削。 注入约 50微升（20毫克）曲安西龙或稀释的荧光素（ 约 0.1毫克/毫升）玻璃体内到玻璃体中可视化和促进（近总）除去在后极和midperiphery浮动玻璃体。避免在镜头下穿越而过。如果气体填充需要建议压痕由（熟练）助理刮胡子周边玻璃体。 添加20单位/毫升肝素和0.5毫克肾上腺素0.001毫克/毫升终浓度到BSS输注溶液中平行或步骤4.10之后。 注：由于肝素/肾上腺素不注射人工它们的影响取决于输液流速推迟。 5.装载射手注：本文所描述的工作不赫尔辛基宣言的原则下回落;它不涉及人类患者。在这里，站ndard RPE细胞从胎儿人眼，培养和分化的未涂覆10微米厚的聚酯（PET），根据我们的先前公布的协议14插入隔离。从波恩大学的伦理委员会，获得与人类胎儿的物质工作的权限。可替代地，HES-RPE是从Skottman实验室（手稿中制备），在那里他们被根据由Vaajasaari 等人所述的技术中培养运32。用于这些细胞的一个权限已从R.科赫研究所，柏林，德国获得。 准备与眼科的BSS植入的3倍之前，冲洗细胞培养。 填用10ml眼科级BSS标准细胞培养皿（100×20毫米）。 添加细胞培养插管进入BSS和在光学显微镜下居中菜。 切出一个2.4×1.1毫米植入物用钝，椭圆形，定做针获得平，豆形底具有两个长边和两个圆边。 通过与BSS第二端口轻轻淹没针冲洗出植入到BSS填充定制装载站（ 图1）。 任选切割植入物（<0.5mm）的一个圆形端部，只是以获得第三边缘。 确保植入物是在通过确保单层是细胞载体上上行的正确方向。要改变定位小心使用两个手术刀。 轻轻地完全推植入利用持针器，直到所有的植入物的固定尖端的内部射手仪器。柱塞应保持缩回。 请BSS下装载站的“装”射击枪，直到植入的时刻。 6.植入引桥连接到气密注射器可扩展41克视网膜下注射针神经视网膜（确保所有气泡已被紧急疏散从管！）。 注入BSS（钙和镁/ CM）视网膜下，从而创造大约2的疱视网膜脱离（BRD） – 3-盘直径（DD）。每眼两个BRD可以安全地得到提升。 放大性视网膜至1.5毫米，垂直23政VR-剪刀。视网膜下空间是现在用于植入或进一步操纵访问。 扩展巩膜（精确）用1.4毫米的切口刀至20g的方法。 尝试使用20G的虚拟射手通过巩膜传球，因为需要确保加载射手平稳，但舒适的过渡放大。 通过巩膜与加载的射手27最好通过在24毫米汞柱。 办法性视网膜边缘并从视网膜前位置视网膜下弹出植入物。 调整种植与半封闭的23政剪刀，镊子或41克的针，以确保它是retina-下定位以及从性视网膜合理了。 7。结束操作卸下地下25吊灯和输液插管。 缝合巩膜所有。 由8点巩膜（前最后缝合巩膜）注入25微升（10毫克），曲安西龙。 检查/触诊调节眼压，并通过为30G针头/注射器注入BSS，如果需要的话。 缝合结膜与7-0薇乔。 删除proptosing 3-0丝线吊带慢（避免眼眶深部静脉丛！）。 下盖添加地塞米松/抗生素软膏。 1小时的位置覆盖有与操作眼朝上（W / O型气体），或下（空气/气体）毯。 直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨靠着不要让动物无人值守。 麻醉消失完全前不要运兔，这可以通过注射美托咪定倒车代理等于量所给出的美托咪啶可加快。 8.术后动物护理保持兔适当的条件（温度，光照，食物，水，空间等 ），并在一个专门的机构密切监测之下。 确保动物是很好的休息， 即 ，食物或水匮乏没有长时间。 寻找任何伤口或受伤，尤其是在注射部位。 保持伤口干燥，防止感染。给予抗生素怀疑感染时：地塞米松1毫克/克，硫酸新霉素3500 IU /克，多粘菌素B 6000国际单位/克软膏进行术后1周，每天两次涂在眼球表面。 每日两次添加未来7天的术后地塞米松/抗生素软膏更好的眼表面再生，减少术后疼痛。 给全身镇痛药（Carprofene 4毫克/千克，每日两次），初始48小时。 无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨靠着不要让动物。 不要返回一个神兽经历了手术给公司其他动物，直到完全康复。 不要暴露动物不必要的困扰。 9. SLO / SD-OCT指导准备和使用注射针筒1含0.175毫克/千克氯胺酮和0.125毫克/千克美托咪定为开始27克肌肉注射针（IM）麻醉。翻转注射器混合。 添加润滑剂至少每5分钟滋润眼睛并保持清晰的SD-OCT成像，可选可以使用自定义的隐形眼镜。 附加一个钢平台到头枕稳定动物在所需位置。 放置在钢平台的兔子，把它的眼睛垂直探针。 从下腮骨（下颌骨）避免气管握住兔子的头。 倾斜动物的头由大约45度朝向的SD-OCT探针，以优化在植入物上的观看角度。 使用30度镜头及选择以下参数进制OCT成像[HS]：单行30度设置，设置为100（平均）ART模式和值设置为15 ART模式扫描体积20×20度的设置进行扫描;不要求高分辨率模式。 用SLO红外线反射成像找到植入物（ 图2A）的焦平面;最佳的对焦当达到（全部）种植体边缘锋利14。 完成后，加入地塞米松1毫克/克，硫酸新霉素3500 IU /克，多粘菌素B 6000国际单位/克软膏下盖。