ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

眼科研究における動物の扱いの倫理：我々は、医学部の倫理委員会の承認を得たボン大学、およびビジョンと眼科研究協会（ARVO）が述べているガイドラインに準拠しています。また、すべての手順は、ノルトライン=ヴェストファーレン州の州の規制当局によって承認されました。食料と水に自由にアクセスで標準化された個々のケージで20℃で、定期的な昼光への曝露、 – 動物は、18の間の温度とエアコンの専門施設で屋内で開催されました。 注：動物に手術の親和性を確保するために、動物の健康のスコアシートには、以下の決定的な動物の除外基準含まれて続いている：入院時の体重と比較して20％の重量損失を、動物の見かけのチアノーゼ。動物震え、けいれんを持っているか、協調して移動することはできません。運動失調/感覚異常、 例えば 、麻痺させます。無関心;極端な自動切断（皮膚創傷、切断肢）。 </ P> 1.機器の滅菌超音波浴中で再利用可能な器具を配置します。 500ミリリットルの蒸留水と機器消毒剤の2ミリリットルを追加します。 15分間掃引機能を使用してクリーン機器。 超音波浴から楽器を削除し、5分間蒸留水を用いてすすぎます。 オートクレーブ内の器具を挿入し、標準的なプログラム（20分121ºC下に楽器の消毒）を使用します。 2.機器の準備密室、手術用スクラブを着て、マスクやヘアカバーに働くことによって、無菌領域を確立し、維持します。無菌手術用手袋を着用しての前に手を消毒。詳細なアプローチについては28を参照してください。 滅菌ドレープの滅菌器具を配置します。 注射のための27 G針、バランス塩溶液（BSS）で10mlの注射器に取り付けられた40mgのトリアムシノロンを充填した1mlシリンジ、および5ミリリットルのシリンジOを配置ドレープ上のF潤滑剤。 3-0絹、7-0 VICRYL、眼スティック（結膜/強膜出血を止めるために）、ツイスターガーゼスポンジ、創傷閉鎖ストリップ（硝子体切除先端チューブを固定するために）、およびドレープ上のシャンデリアendoillumination繊維線を配置します。 25 Gシャンデリアendoilluminatorのラップを解除し、滅菌技術を用いて、光のマシンに接続する（ステップ2.1参照）。滅菌技術を使用して、硝子体切除機に高速vitrectorとベンチュリカセットを含む硝子体切除セットを接続します（ステップ2.1参照）。 500ミリリットルBSSボトルを開き、製造元の指示に従って、ベンチュリカセットにソリューションを接続します。 動物の麻酔とポジショニングの調製正確な投薬用量を確保するために動物を計量。 0.35ミリグラム/ kgのケタミンとスタートのために0.25mg / kgのメデトミジンを含む27 G針を1シリンジを用いて筋肉内（IM）麻酔を準備します。ミックスする注射器を反転します。 1/3トンで2注射器を準備彼は運転中に麻酔を維持するために、用量。 静脈内注入の代替として、5％グルコース溶液および皮下注射のために18 G針の20ミリリットルを含む注射器を準備します。 散瞳目の3×1滴は瞳孔拡張のための硝子体手術の前に下がる与えます。 毛布で覆いウサギは、麻酔注射の前に落ち着か30秒間注入部位の周りの後肢（臀筋）やマッサージに注入します。 注：IM麻酔の最初のショットは、約1持続 – 2時間を。ウサギのサイズに応じて、薬物耐性、脂肪層、応力及び体温。 45分 – 色褪せ麻酔の最初の兆候は、眼振（外科医によって監視されなければならない）、約30最後のその後の注射です。 催眠、反射低下、鎮痛および動物の筋肉の弛緩を検証することにより、適切な麻酔を確認してください。 ウサギは無意識になると、首の皮膚のひだに皮下注射白金（Pt。3.3）を得ました。 methylcを追加ellulose潤滑剤ごとに5 – 運営眼の中の10分は、非操作眼に潤滑剤やテープ蓋を追加します。 手術用顕微鏡下（鼻が少しブランケットの金型を通って上昇し、それが眼の表面と同じ高さ）は、このような最適な位置に綿毛布のようなカバーで覆われた手術台に覆われたウサギを置きます。顕微鏡の対物レンズに垂直に目を合わせます。 直腸温度計（正常体温39±1ºC）29を使用して、適切な身体コア温度を確認してください。 術後感染を減らすためにハサミ（ブレード上のいくつかの軟膏）を使用して、まつ毛をカット。 局所的に1分間0.1グラム/ミリリットルポビドンヨードの3滴と滅菌BSSで洗い流し – 2を使用して目を駆除。 目に途中でプレカット開口部を備えた滅菌ドレープで目を覆い、その後（スティッキー）外科的切開ドレープで12×17センチカバーしています。 4.硝子体手術 INVを使用して3-0絹とProptoseとセキュアな目ertedキャリパーとは、結膜peritomyを行います。 角膜輪部に近いが、血管から十分vannasシザー（〜1ミリメートルの距離）と結膜を切開。 「T-カット」を作成することにより、結膜を解剖。まず、角膜輪部にはさみ平行でperitomyを拡大してから約6のための「T」の形で垂直に結膜を切開 – 7ミリメートル。慎重にぶっきらぼうに結膜を分離します。 慎重に視神経に向かう方向に刃の鋭い先端を挿入することにより、右眼/ OD（左目/ OS上の4時）に8時23 Gのmicrovitreoretinal（MVR）のブレードを用いて、強膜切開を行います。ゆっくりと同じ方向にブレードを撤回し、強膜切開を拡大することは避けてください。 挿入し、7-0絹縫合糸を用いて縫合カスタムサイドポート注入カニューレ27と24 mmHgので眼圧（IOP）を設定します。 OD（10 O '上の2時位置に25 Gフラットヘッドトロカールと強膜切開を行います; 4.2工程と同様のOS上のクロック）。 粘着テープで固定すると、約 30％で光源をオンにし、フラットヘッドのトラカールに25 Gのシャンデリアの光を挿入します。 必要に応じて、より良い眼内視覚化のための＃20メスを用いて浮腫状角膜上皮を除去します。 結び目を作ることなく、OD上の10時（OS上の2時）、（前）場所のU字型強膜切開の周りに7-0縫合糸で4.2ステップ、および硝子体切除カッター先端を挿入する同様の強膜切開を行います。 最大で小片に硝子体液を切断することにより、高速vitrectorを使用して、視神経乳頭と線維のmedullaresにわたって継続し、その後、入口ポートの周りに硝子体切除術30を起動します。 2000 – 最大で吸引/分3,000カット、。硝子体切除機の述べたパラメータ設定を使用して200 mmHgの（ 表1） 後極Aの上に高速vitrectorを保持することによって網膜から硝子体液を分離することにより、後部硝子体剥離（PVD）を実行ND（優しく可能であれば）ディスク31のみ最大で吸引しながらの優れました。切断せずに200 mmHgで。 硝子体内に可視化し、容易にするために、約 50μlの（20mg）をトリアムシノロンまたは希釈フルオレセイン（ 約 0.1mg / mlの）（合計近く）硝子体切除時の後極とmidperipheryオーバーフローティング硝子体の除去を注入します。レンズの下にクロスオーバーは避けてください。ガスタンポナーデを希望する場合（熟練）アシスタントによって周辺硝子体を剃るためにインデントが推奨されます。 でBSSの点滴液に0.001ミリグラム/ mlの最終濃度になるように20単位/ mlのヘパリンおよび0.5 mgのエピネフリンを追加し、パラレルまたはステップ4.10の後。 注：ヘパリン/エピネフリンは、眼内注入されないように、その効果は、注入流量に応じて遅延されます。 5.読み込んシューター注：本明細書で説明する作業は、ヘルシンキ宣言の教義に該当しません。それは、ヒト患者を伴いませんでした。ここでは、駅ndard RPE細胞は、ヒト胎児の目から単離し、培養し、コーティングされていない厚さ10μmのポリエステル（PET）に分化させた私たちの以前に公開されたプロトコル14に従って挿入します。ヒト胎児材料で作業する権限はボン大学の倫理委員会から入手しました。また、ヒトES-RPEは、それらがVaajasaari らによって記載された技術に従って培養したSkottmanラボ（。準備中の原稿）、から出荷された32。これらの細胞の許可はR.コッホ研究所、ベルリン、ドイツから得られています。 前眼科グレードのBSSとインプラントの3倍の調製細胞培養物を洗浄します。 10ミリリットルの眼科用グレードのBSSで、標準的な細胞培養皿（100×20 mm）を入力します。 BSSと中心光顕微鏡下皿に細胞培養インサートを追加します。 フラット、豆状の基板を得ることが鈍い、楕円形、カスタムメイドの針で2.4×1.1ミリメートルのインプラントをパンチアウト二つの長辺と2ラウンドエッジを持ちます。 ゆっくりBSS満たされたカスタムメイドのローディングステーション（ 図1）にインプラントを洗い流すためにBSSを有する第二ポートを介して針をあふれさせます。 必要に応じてちょうど第三のエッジを得るために、インプラント（<0.5ミリメートル）の1ラウンドの端をカット。 インプラントが単層細胞担体上に逆さまであることを確実にすることによって、右方向にあることを確認します。慎重に2メスを使用して位置決め変更します。 インプラントのすべてが先端の内側に固定されるまで、針ホルダを使用して、シューターの機器に優しく、完全にインプラントを押してください。プランジ​​ャが後退したままにしてください。 注入の瞬間までBSS下ローディングステーションの「ロードされた「シューティングゲームのヒントにしてください。 6.移植気密注射器に接続された拡張可能な41 G網膜下注射針とのアプローチ神経網膜（すべての気泡が避難していることを確認してくださいチューブから！）。 3ディスク径（DD） – 網膜下にし、それにより約2のブレブ網膜剥離（BRD）を作成（カルシウム、マグネシウム/ CM付き）BSSを注入します。目ごとに2つのBRDを安全に上昇させることができます。 縦23 G VR-はさみで1.5ミリメートルに網膜切開を拡大。網膜下腔は現在移植またはさらなる操縦のためにアクセス可能です。 20 G・アプローチに1.4ミリメートル切開ナイフで強膜切開（正確に）を拡張します。 ロードされたシューティングゲームの円滑な、まだぴったり移行を保証するために、必要に応じて拡大し、20 Gシューティングダミーを使用して強膜切開を通過しようとしました。 24 mmHgのに理想的な強膜切開を介してロードされたシューター27に渡します。 エッジ網膜切開アプローチと網膜上の位置から網膜下インプラントを取り出します。 それが合理的に離れて網膜切開からretina-の下にも配置されていることを確認する半分閉じた23 Gはさみ、鉗子または41 G針でインプラントを調整します。 7。動作を終了 25 Gのシャンデリアと注入カニューレを外します。 すべてsclerotomiesを縫合。 8時の強膜切開（前縫合の最後の強膜切開）によって25μlの（10mg）をトリアムシノロンを注入します。 チェック/触診によってIOPを調整し、必要に応じて、30 G針/シリンジを介してBSSを注入。 7-0 VICRYLとの縫合結膜。 ゆっくり3-0シルクスリングをproptosing削除（深い眼窩静脈叢を避けてください！）。 蓋の下でデキサメタゾン/抗生物質軟膏を追加します。 ダウン（空気/ガス付）（W / Oガス）を上向きに操作した目と毛布で覆われた1時間の位置、または。 それは胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、無人の動物を放置しないでください。 麻酔が完全にフェードインする前に、これは与えられたメデトミジンの量と同じ薬を逆転メデトミジンを注入することで高速化することができるウサギを輸送してはなりません。 8.術後動物ケアキープ適切な条件（温度、光、食品、水、スペースなど ）や専門施設での綿密なモニタリングの下にウサギ。 すなわち 、その動物が十分に休息であることを確認してください。、食品や水の欠乏の無い長時間。 特に注射部位に、任意の創傷または傷害を探します。 感染を防ぐために乾燥傷を保管してください。感染が疑われる場合、抗生物質を与える：デキサメタゾン1ミリグラム/ gに、硫酸ネオマイシン3,500 IU /グラム、硫酸ポリミキシンB 6,000 IU / gの軟膏を眼の表面上に1週間の術後1日2回適用しました。 優れた眼表面再生および縮小術後の痛みのために一日二回、次の7日間の術後のためのデキサメタゾン/抗生物質軟膏を追加します。 全身鎮痛薬を与える（Carprofeneに4mg /一日二回キロ）最初の48時間。 それは胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 その動物を返さないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けています。 不必要な苦痛に動物を公開しないでください。 9. SLO / SD-OCTガイダンス準備し、0.175ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.125ミリグラム/開始のためのキロメデトミジンを含む27 G針を1シリンジを用いて筋肉内（IM）麻酔を注入します。ミックスする注射器を反転します。 明確なSD-OCTイメージングを目に潤いを与えるし、維持するために、少なくとも5分ごとに潤滑剤を追加し、必要に応じてカスタムコンタクトレンズを使用することができます。 必要な位置に動物を安定させるためにヘッドレストに鋼製のプラットフォームを取り付けます。 プローブに垂直な目を配置し、スチールプラットフォーム上でウサギを置きます。 気管を回避下頬の骨（下顎骨）からウサギの頭を保持します。 インプラント上の視野角を最適化するために、およそ45°SD-OCTプローブに向かっによりチルト動物の頭。 30度のレンズとオプトの次のパラメータを使用します。imal 10月イメージング[HS]：1ライン分の30度設定は100（平均）に設定ARTモードと15に設定ARTモードでボリュームスキャンの20×20度の設定でスキャンします。高解像度モー​​ドが要求されません。 インプラント（ 図2A）の焦点面を見つけるために、SLO赤外線反射率イメージングを使用します。最適な焦点は、インプラントのエッジが14尖っているときに（すべて）に達しました。 終了したら、蓋の下にデキサメタゾンを1mg / gで、硫酸ネオマイシン3,500 IU /グラム、硫酸ポリミキシンB 6,000 IU / gの軟膏を追加します。