Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa, en andere RPE gerelateerde ziekten zijn de meest voorkomende oorzaken van onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen van volwassenen in industrieel ontwikkelde landen. RPE transplantatie lijkt een veelbelovende therapie, aangezien het disfunctioneel RPE kan vervangen, de functie en daardoor herstellen visie.
Hier beschrijven we een methode voor het transplanteren van een gekweekte RPE monolaag op een steiger in de subretinale ruimte (SRS) van de konijnen. Na vitrectomie xenotransplantatie werden afgeleverd in de SRS met behulp van een op maat gemaakt shooter, bestaande uit een 20-gauge metalen mondstuk met een polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate zuiger. De huidige techniek evolueerde in meer dan 150 konijnen operaties meer dan 6 jaar. Post-operatieve follow-up kan worden verkregen met behulp van niet-invasieve en repetitieve in vivo beeldvorming, zoals spectrale domein optical coherence tomography (SD-oktober), gevolgd door perfusie gefixeerd histologie.
the methode heeft duidelijk omschreven stappen voor het eenvoudig leren en hoog slagingspercentage. Konijnen worden beschouwd als een groot oog diermodel bruikbaar in preklinische studies voor klinische toepassing. In dit verband konijnen kostenefficiënt en misschien gemakkelijk alternatief voor andere grote gaten diermodellen.
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van slechtziendheid bij volwassenen in industrieel ontwikkelde landen 50 jaar of ouder, zoals het verlies van het centrale zicht veroorzaakt. Ongeveer 15% van deze patiënten lijden aan de "natte" vorm van de ziekte, waarbij neovascularisatie afkomstig van het vaatvlies en verstoort de retinale functie 1. Deze variant kan worden behandeld door een zeer effectieve therapie met herhaalde intra-vitreale injecties van antiangiogene drugs 2. De overgrote meerderheid van de patiënten (~ 85%) lijdt de droge vorm, die wordt gekenmerkt door extracellulaire afzettingen (bijvoorbeeld drusen) onder het retinale pigmentepitheel (RPE). Deze afzettingen veroorzaken RPE disfunctie leidt tot retinale atrofie in de macula. Gezien het ontbreken van een curatieve therapeutische opties, AMD zich ontwikkeld tot een intensief ontwikkeling van onderzoek gebied, waar veel verschillende curatieve therapeutische benaderingen worden getest. Chirurgische RPE vervangingeen aantrekkelijke toekomstige mogelijkheid om deze slopende ziekte 3 verslaan.
Autologe transplantatie subretinale RPE vervangt disfunctioneel of verloren RPE in macula, en heeft het potentieel om de fysiologische functie 4-9 herstellen. Deze chirurgische techniek had een doorbraak bij de ontwikkeling van RPE protocollen differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), waardoor de wetenschapper een onbeperkte bron van cellen voor transplantatie RPE 10. RPE transplantatie wordt nu erkend als een aantrekkelijke first-in-toepassing op de mens voor stamcellen afgeleid geneeswijze. Het oog biedt een uitstekende chirurgische toegang en verfijnde in vivo monitoring tools 11-13.
Om de RPE te transplanteren, een manier is met een minimaal invasieve levering met behulp van een cel suspensie, als alternatief, om beter te bewaren RPE karakteristieken en transplantatie-functie, kunstmatige carrier substrAtes (scaffolds) voor RPE vervanging worden overwogen 4,14,15. Grote diermodellen nodig zijn voor preklinische validatie, maar toch gedetailleerde technische informatie over dierlijke behandeling en chirurgische techniek ontbreekt tot op heden 16-23.
Wij en anderen 11,24 hoewel er aanwijzingen van het tegendeel 25, suggereren het gebruik van een stijf doch elastisch dragersubstraat omdat het werk veiliger, behoudt monolaag integriteit en functionaliteit. Na verloop van tijd hebben we een aantal speciaal ontworpen instrumenten en aanverwante technieken getest op de implantatie van cel-carrier ondersteund RPE transplantaties in de subretinale ruimte (SRS). We gebruik gemaakt van intra-operatieve video-opnamen, in vivo scanning laser Ophthalmoscopie gecombineerd met spectrale domein optical coherence tomography (SLO / SD-oktober), en histologie aan de implantatie succes 14,26,27 te evalueren. Hier bieden wij onze huidige aanbeveling voor subretinale RPE implantaten bij konijnen,die werden getest in 5 verschillende konijnen stammen, 7 cel dragermaterialen en 4 RPE celbronnen in meer dan 150 procedures.
Met behulp van een konijn model, is een veilige en reproduceerbare methode gepresenteerd voor transvitreal levering van gekweekte RPE op mobiele dragers in de subretinale ruimte met een op maat ontworpen shooter instrument. De beschreven methode biedt een korte / geoptimaliseerd chirurgische techniek voor het eenvoudig te leren, omdat het gaat om standaard technieken bij vitrectomie met subretinale manoeuvres. Uitkomst wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door een schone vitreoretinale interface en intra-oculaire infuus dat vloeistof turbulentie vermijdt over de implantatie, het induceren van bleb netvliesloslating (BRD) bij lage IOP, het voorkomen van netvlies en schade sclera door de droogte en de juiste positionering van het konijn.
Wij waarschuwen Aangezien verscheidene intra-operatieve complicaties allen tijde voorkomen, belemmeren het succes van de implantatie, bijvoorbeeld intra- oculaire bloedingen, anaesthesie vervagen in essentiële stappen zoals de implantatie inklappen van BRD vanwege instrument manipulatie of oculaire hypotonie, rAbbit overlijden als gevolg van overmatige doses van de anesthesie, lage bloeddruk tijdens lange operatie waardoor hypoxische hersenschade of hyperthermie. Maar deze complicaties af met de tijd als ze snel worden aangepakt en opgelost door het verhogen van de ervaring van het chirurgisch team.
Sommige complicaties zou kunnen worden verminderd door het volgen van een paar eenvoudige, maar cruciale stappen. Smeermiddel worden toegevoegd om de 5-10 min cornea, sclera en conjunctivale beschadiging tijdens gebruik te voorkomen, en het handhaven van een duidelijke intraoculaire media, kan gedroogde / zwart sclera oorzaak van wonddehiscentie, wat leidt tot oculaire hypotonie en zijn / of intra-operatieve lekkage van sclerotomies. Heparine moet worden toegevoegd om de vorming van fibrine een film die bijzonder subretinale implantatie uitdagende en tegelijk toevoegen van epinefrine verminderen bloeden onder heparine 16 maakt voorkomen. Te lange heparine / epinefrine belichtingstijden (> 1 uur) te worden vermeden cornea ede voorkomenma door endotheliale decompensatie 33, hypertensieve crisis of intra-operatieve fataliteit. Nauwgezet glasvocht verwijderd dient te worden uitgevoerd op instrumenten (ingang) poort aan het netvlies en / of choroïdale detachementen te voorkomen. Intra-oculaire instrumenten moeten worden wees in de richting posterior pool tot lens touch (oorzaken iatrogene cataract) of (post ter plaatse) schade aan het netvlies te voorkomen. Een intraoculair zijpoort infusiecanule worden gebruikt, omdat het vermindert de straalstroom rond het implantatiegebied, waardoor ongecontroleerde scheuren van de retinotomy en ineenstorting van de BRD voorkomen. BRD inductie in de middellijn (verticale as van de oogzenuw) of in de buurt van optische vezels medullaire moet worden vermeden om uitgebreide iatrogene netvliesloslatingen voorkomen. Ten slotte, last but not least BRD moet worden geïnduceerd bij lage IOP, om subretinale BSS injectie te vermijden gebruik van buitensporig debieten die kunnen leiden tot schade aan het netvlies (bijv., Door rekken).
Veel onderzoek variabelen zoals mobiele carrier varianten, foetale, volwassene of stamcel afgeleid RPE cel bronnen, keuzemogelijkheden voor immunosuppressiva, enz., kan worden verkend 14,26,27,34. Verdere verbetering zoals serum-vrij RPE kweekmethoden, karakterisering van xenoRPE in subretinale ruimte, het verwijderen van de gastheer RPE laag 14 of strategieën voor het implantaat verankering zijn de huidige work in progress.
Tot op heden zijn de beschreven technieken zijn gebruikt op 5 verschillende konijn stammen, met inbegrip van chinchilla bastaard, Chinchilla bastard / KBL hybriden, Nieuw-Zeeland White / Rode Kruis, Nieuw-Zeeland White (albino) en Nederlands gordel. Zowel mannelijke als vrouwelijke konijnen werden geopereerd met konijnen tenminste 1,5 kg of 2 maanden (afhankelijk van soort). De meeste operaties waren op gepigmenteerde konijnen (chinchilla bastard of chinchilla bastaard hybriden) met gewichten tussen 2,5-3 kg.
Al het konijn stammen hebben we de kans om te werken met moesten lijken sommige eigenaardigheden hebben. Gezien de exclusive beschikbaarheid van gepigmenteerde konijnen van de chinchilla bastard stam in Duitsland in 2009-13, hebben we de meeste ervaring met deze dieren verzameld. Helaas is niet meer beschikbaar omdat de fokkerij is stopgezet, maar steekt zeer goed Nieuw Zeelandse witte / Rode Kruis behalve voordeliger dikker sclera en groter oog volumes in de laatste. Chinchilla bastard hybriden hebben aanzienlijke intra-operatieve fibrine vorming en vereisen heparine / epinefrine gebruik zoals hierboven beschreven om ervoor te zorgen succesvolle subretinale manoeuvres. Dit protocol is ook uitgevoerd in niet-gepigmenteerde albino konijnen (New Zealand White), echter bijzonder BRD Creatie en subretinale implantatie moeilijker gezien verminderd contrast waardering. De haalbaarheid van het induceren van een glasvochtloslating leek niet konijn stam afhankelijk in onze handen.
Transvitreal subretinale levering is waarschijnlijk de toekomst chirurgische strategie van keuze gezien is het de meest comm onderweg tegenwoordig klinisch om het netvlies. Als gevolg hiervan vele andere groepen zoals technieken hebben ingediend voor gekweekte RPE op carrier ondersteunt in dierlijke werk 11,15,23,35. Aramant et al. 36 een instrument dat in plaats plaatst duwt de hydrogel-ingekapselde zachte implantaat om haar subretinale doelplaats. Het ontwerp van Thumann et al. Maakt gebruik van een holle spatel, die de vervoerder ondersteunde implantaat releases door drijvende het uit door middel van vloeistofinjectie 19. Beide voormalige strategieën vereisen subretinale inbrengen van het instrument, dat naar onze mening is meer kans op complicaties, in vergelijking met een epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. 22 beschreef een subretinale inserter instrument voor de levering van subretinale chip implantaten bij varkens, maar verder geen werk is sinds om het beste van onze kennis gepubliceerd. We hebben kunnen de beschreven techniek uitbreiden enige wijziging varken geweest.
jove_content "> Ons geprefereerde cel dragers 10 micron dikke polyester (PET) membranen. Vanuit chirurgisch perspectief, dit materiaal gunstige stijfheid en elasticiteit parameters, naast de brede toepassingsgebied in celcultuur experimenten. We hebben vergelijkbare ervaringen met uitgebreide tetrafluorethyleen (ePTFE) 37 of nanovezel membranen electrospun uit PET, poly-melkzuur / capronolactic acid (PLCL) of poly -. melkzuur-co-glycolzuur (PLGA), alsook samengestelde nanovezel (PLGA of PET) en ultradunne PET 26 Wanneer PET membranen worden gebruikt ons metallic schutter instrument, ze hebben incidentele neiging tot elektrostatische lading, die het uitwerpen uitdagingen van de schutter 27. Ultradunne polyimide membranen kunnen in onze handen niet worden geïmplanteerd in de subretinale ruimte met de hierboven geschetste protocol vertonen ( manuscript in voorbereiding).Marmor et al. hebben systematisch bestudeerd spontane resorption van subretinale vloeistof in iatrogene gelokaliseerde netvliesloslatingen 38-41. Zelfs na manipulatie in de subretinale ruimte werden deze gevonden te worden opgenomen door postoperatieve dag 4 in rustig ingrepen. Laser retinopexie niet uitgevoerd om de randen van de retinotomy verzekeren. Hoewel de contra-intuïtief in vergelijking met de menselijke ingreep, wordt de lucht / gas tamponnade niet vereist. Tenzij zorgvuldige verwijdering van perifere glasachtige kan worden bereikt, met name in de hogere kwadrant, kan in feite leiden tot grote netvliesscheuren afkomstig van de retinotomy plaats. Het is alleen aan te raden om de vloeistof lucht uitwisseling met de daaropvolgende 20% SF6-gas tamponnade uit te voeren om intraoperative iatrogene netvliesloslatingen of bij een bepaalde positie van het implantaat moet worden beveiligd redden.
Hoewel de mechanisch geïnduceerde ablatie van de neurale retina en RPE fotoreceptor schade bij konijnen 42,43 veroorzaken, de omvang varieert (zelfs regelmatig BSS) dehankelijk van factoren zoals IOP, spuittype gebruikte injectievolume met daarbij geïnduceerde retinale strekken, enz. We hebben ook getest het vaak aanbevolen Ca / Mg-vrij BSS gefaciliteerd onthechting 42-44, maar vond dat het veroorzaakt intraoperatieve lens vertroebeling (met name bij verhoogde temperatuur), en aanzienlijk vertraagt of zelfs schaadt het netvlies re-bevestiging 27. Langzame subretinale injectie van 20-30 ul volume van de reguliere BSS met een 100 ul spuit wordt daarom aanbevolen; injectienaald bewegingen moet minimaal zodat de retinotomy afdichtingen rondom het zijn en het voorkomen van Bruch's membraan schade. Sommige van de iatrogene schade kan worden opgelost door RPE wondgenezing, en de waargenomen relatieve behoud van ONL dikte na herbevestiging, suggereert dat de RPE / fotoreceptor complex deze stoornis kan tolereren, zoals ook beschreven door anderen 45.
-Cellen gebaseerde therapieën of netvlies protheses nodig preklinische animal testen voorafgaand aan de reglementaire goedkeuring en de veiligheid van de mens studies te beginnen. De voormalige verschillen van land tot land. Het konijn model hier beschreven, kan dienen als een kostenefficiënte en minder uitdagend platform voor het vaststellen van of zelfs het uitvoeren van alle eisen door de regelgevende instanties. Bovendien kan zij vervolgens dienen voor de opleiding van chirurgen in de uiteindelijke multicenter klinische onderzoeken of verdere verbeteringen van de techniek langs de weg.
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door Rüdiger Foundation subsidies in 2008 en 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinees Scholarship Raad nr 2008627116 (ZL) en een onbeperkte subsidie door Geuder AG, Heidelberg (afb. 2). De leden van het laboratorium H. Skottman's, worden Universiteit van Tampere Finland erkentelijkheid voor het verstrekken van hES afgeleid RPE weergegeven in figuur 2.
s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75L |
DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23L |
Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1ml x3 2ml x3 5ml x1 10ml x1 20ml x1 |
Needle | BD | 305196 305136 |
18G x 1 27G x5 |
Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60×40 cm x2 12×17 cm |
Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66×5 mm |
Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25G incl. trocar |
Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23G |
Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 1x23G |
3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x23G 1x20G |
7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41G |
VR scissor | Geuder | G-36542 | 25G |
Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23G |
Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23G |
Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
Flute needle | DORC | 1281.SD | 20G (Vacuum) |
Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100µl |
Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg 工学 |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
Drugs and solutions | |||
Name | Company | Active agent | コメント |
Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2L |
Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2L |
Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10ml (100mg/ml) |
Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10ml (1mg/ml) |
Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10ml (5mg/ml) |
Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10ml |
Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10ml (5mg/ml) |
Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10g |
PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500ml |
Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100ml |
Heparin-Natrium-25 000 | Ratiopharm | Heparin | 5ml (2500 unit/ml) |
Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1ml (1mg/ml) |
Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1ml (40mg/ml) |
Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10ml |
Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30ml (1g/10ml) |
Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10ml |