Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
פרוטוקולים להפקה אוכלוסיות של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים פותחו, אבל אלה כלליים מניבי תאים של פנוטיפים מעורבים. חוקרים המעוניינים לצאת ללימודים מעורבים תת myocyte ספציפי דורשים גישת בידול מכוונת יותר. על ידי טיפול עכבר גזע עוברי (ES) תאים עם Grem2, אנטגוניסט BMP מופרש כי הוא הכרחי עבור היווצרות תא פרוזדורי in vivo, מספר רב של תאי לב עם פנוטיפ פרוזדורים יכול להיוצר. שימוש הקו התאי גזע Myh6-DsRed-NUC פלוריפוטנטיים המהונדס מאפשר זיהוי, בחירה, וטיהור cardiomyocytes. בפרוטוקול זה גופי embryoid נוצרים מתאי Myh6-DsRed-NUC בשיטת ירידה התלויה ונשמרות השעיה עד יום בידול 4 (D4). בשעת תאי D4 מטופלים עם Grem2 מצופה על צלחות מצופות ג'לטין. בין D8-D10 באזורים וקבלנים גדולים הם נצפו בתרבויות ולהמשיך להתרחב מature דרך D14. מולקולרי, היסטולוגית electrophysiogical מניתוח תאים בתאים שטופלו Grem2 רוכשים תכונות פרוזדורים דמויים מתן מודל במבחנה ללמוד את הביולוגיה של cardiomyocytes פרוזדורי תגובתם סוכנים תרופתיים שונים.
תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא כלים רבים עצמה ליצירה ולומד על תאים מפני שורה של קשה לרקמות גישה ללימודי מחקר בסיסיים פרה-קליני, במיוחד אצל בני אדם 1-5. אפנון תקין מסלולי איתות התפתחותי יכול לכוון את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לגורל פנוטיפי הרצוי. פרוטוקולים רבים פותחו כדי ליצור cardiomyocytes (CMS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים 6-14. פרוטוקולים אלה כרוכים אפנון בדרך של TFGβ superfamily (Activin, BMP ו- TGFβ) ו Wnt מסלולי דרך בנוסף מתוזמן של גורמי גדילה אקסוגניים ו / או מולקולות קטנות 10,12-15. פרוטוקולים אלה הם בדרך כלל יעילים להגדיל את אחוז התאים שהופכים CMS, אבל החוסר ספציפי, יצירת אוכלוסייה מעורבת של תאי מייצגי פרוזדורים, חדרית, שושלות מערכת קטרים / הולכה. על מנת ללמוד לב ספציפי לגבי תת-appro בידול מכוון יותרACH נדרש.
Gremlin2 (Grem2, המכונה גם החלבון הקשור לדן סרברוס או PRDC בקיצור) הוא אנטגוניסט BMP מופרש דרוש בידול לב ראוי היווצרות תא פרוזדורים במהלך התפתחות לב דג הזברה 16. טיפול בתאי גזע עובריים הבחנה עם Grem2 ביום בידול 4, רק לאחר ביטוי השיא של סמנים mesodermal T-Brachyury ו סרברוס כמו 1, מגדיל את התשואה של CMS ומייצר מאגר של תאים בעיקר של השושלת פרוזדורים 14.
רקומביננטי Grem2 משמש לטיפול בתאי ההבחנה והוא יכול להתבצע באמצעות טכניקות ייצור חלבון סטנדרטי 17 או ניתן לרכוש מסחרי. זה מאוד מסיס בתמיסות מימיות ניתן להוסיף exogenously לתרבויות בנקודת הזמן הרצוי.
בידול ניתן לעקוב באמצעות RT-qPCR לכמת ביטוי נציג סמניםשל אבות לב וכלי דם, אבות לב, ומחויב CMS. Immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לזהות ולדמיין פריסה המרחבית של סוגי תאי לב.
יישומים הדורשים אוכלוסיות טהורות יותר בקלות להתבצע בעת שימוש במערכת כתב לזהות ולבודד CMS. לענין זה, הצגנו את αMHC-DsRedNuc לבנות לתוך הקו הסלולרי העכבר CGR8 ES 14. תאי CGR8 לגדול ולהישאר pluripotent ללא תאים מזינים, הקלת מבחני רחבה והבחנה 18. השורה בתאי הגזע העוברית מכילה רצף קידוד חלבון פלואורסצנטי DsRed עם אות לוקליזציה גרעינית תחת שרשרת לב ספציפי אלפא שרירן הכבד (אלפא MHC או Myh6) אמרגן גן. באמצעות תאים אלה, CMS ניתן לזהות בקלות ומבודד כימות, מיון התא, אלקטרופיזיולוגיה, מסכי סמים, ולומדים מנגנוני התמיינות פרוזדורים.
פרוטוקול זה מייצר תרבויות שיגרתיות עם אחוז גבוה של CMS אופייניים שושלת הפרוזדורים. כמו עם כל פרוטוקול בידול, איכות mESCs לפני הבידול יש לתת תשומת לב מיוחדת. mESCs צריכה להיות במעקב שגרתי עבור מורפולוגיה נכונה (איור 1 א). כל התמיינות ספונטנית המתרחשת לפני ההיווצרות ש…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי HL083958 מענקי NIH ו HL100398 (AKH) ו 2T32HL007411-33 "תכנית ב מנגנוני לב וכלי דם: הכשרת החקירה" (JB).
GMEM | Life Technologies | 11710 | |
FBS | Life Technologies | 10082 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
BSA | Sigma | 5470 | |
0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |