マルチターゲット発色ホールマウント<em>その場で</em>ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em>ショウジョウバエ</em>胚

in vitro転写により RNAプローブの1ラベリング RNaseフリーの条件下で1.5ミリリットルマイクロチューブ内のin vitro転写反応を組み立て：10.5μlのDEPC処理H 2 O、4.0μlの5×転写バッファー、1.0μlのDEPC処理H 2 O（1μgの）直線化、精製された鋳型DNA、 1.3μlのNTPミックス、0.7μlのハプテン標識UTP、0.5μlのRiboLockのRNA阻害剤、2.0μlのRNAポリメラーゼ。 注：最終反応体積は20μlです。 テンプレートのプロモーター配列の使用T7に応じて、 インビトロ転写のためにT3またはSP6 RNAポリメラーゼ（17を参照する参照）。 RNAプローブのラベルとしてジゴキシゲニン-11-UTP、ビオチン-16-UTP、またはフルオレセイン12-UTPを選択します。詳細については、 議論にハプテン-ラベルとプローブ濃度の説明を参照してください。 転写反応を混合し、すぐにスピンダウン。 転記してみましょう37℃で3時間。 私は、鋳型DNAを除去するための転写反応に1μlのRNaseフリーのDNaseを追加よく混ぜ、37℃で15分間インキュベートします。 DEPC処理H 2 Oを200μlにサンプルボリュームを調整します。 標識RNAプローブを沈殿させ、100μlの（0.5体積）7.5 M酢酸アンモニウム及び600μlの（3体積）エタノールを追加します。 RTで30分間インキュベートします。 これが組み込まれていないヌクレオチドの不要な析出につながる可能性として、氷冷エタノールを使用しないでください。 20℃で30分間、最大速度（20,800 XG）で温度制御された遠心分離機で転写されたRNAをスピンダウン。慎重に上清を吸引。 20℃で10分間、20,800×gで70％RTでエタノール、遠心分離で得られたペレットを洗浄します。 上清を除去し、誤って緩いペレットを吸引しないように注意してください。室温で数分間開いた蓋をマイクロチューブにペレット空気が乾燥してみましょう。 ディスDEPC処理H 2 O100μl中得られたペレットを解決 -20℃で300μlのプレハイブリダイゼーション緩衝液を加える（50％体積/体積の脱イオンホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlのヘパリンナトリウム塩、0.1％体積/体積のTween-20を、5 mg / mlのトルラRNA）とストア。プローブは、長期的には、-20℃で保存することができます。 注意：新たに転写されたプローブの最初のテストをご希望の実験のための最終濃度を得るために、100μlのハイブリダイゼーション緩衝液で3μlのハプテン標識RNAプローブを希釈します。 インサートの使い方胚試料の2処理注：異なるインキュベーション工程を通じて胚を処理するためのマイクロチューブまたはマルチウェルプレートを使用すると、誤って溶液の交換中に、それらを吸引することにより、胚のかなりの量を失うリスクを負います。この損失を避けるために、手順を介して、胚サンプルを搬送するための（例えば、Netwe​​llインサートなど）バスケットを使用することが有用であり得ます。これらは中ポリスチレン胚は、処理中に休まれた下部（ 図2A）でのポリエステルメッシュ、とserts。 WISHの手順で胚を処理するために、12ウェルプレート（ 図2B）に挿入を組み立て、各ウェルに適切な溶液2mlを追加します。 ブルーチップを用いてインサートに胚をピペット。すべての胚を液体に浸されていることを確認します。 インキュベーション時間は、場所に次の工程のための溶液が充填されている別の12ウェルプレート中の胚を含むインサートである場合。 別の解決策（ 図2D）から一度に12サンプルまで転送するために、キャリアとハンドル（ 図2C）を使用します。 注：必要なボリュームを減らす染色反応（ステップ6.2）のためのプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション段階（ステップ4.1を参照）、24ウェルプレートのために2.0ミリリットルのマイクロチューブを使用します。ハイブリダイゼーションおよび染色反応は100のボリュームで実行されています1; lであり、それぞれ400μlを、。 ハイブリダイゼーションのための胚の調製 、dechorionate、収集修正し、標準的な手順14,18を使用して胚をdevitellinize。準備された胚を日常-20℃でメタノール中に保存されます。 移植胚を室温にin situハイブリダイゼーションのために使用し、ウェルあたり2 mlのメタノールを充填した12ウェルプレートのインサート内に分配されます。 RTで減少メタノールシリーズを通して胚を再水和。 （I）1×PBS中の75％メタノール1×PBSにおける（ii）の50％メタノール、0.1％Tween-20を含む1×PBS中の（iii）の25％メタノール、0.1％のTween-20（IV：で胚を3分毎にインキュベート）PBS、0.1％のTween-20（v）の1×PBS、0.1％のTween-20を1倍。 RTで20分間、1×PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で胚を予め固定します。 室温で1×PBS中で3分間、0.1％のTween-20を4回洗浄した固定液を除去します。一方、解凍し、プロテイナーゼKおよびグリシンワーキング溶液を調製。 <li>新鮮なプロテイナーゼKで透過性の胚1×PBS中、室温で0.1％のTween-20で3分（50μg/ mlのへの10μg/ mlの）。 注：プロテイナーゼK処理は、胚の固定の強度にバランスします。予備固定工程（3.4）が省略されている場合、例えば、軟らかいプロテイナーゼK処理を適用することができます。 0.1％Tween-20を室温で2ミリグラム/ 1×PBS中mlのグリシン、中2 1分リンスして反応を停止します。 室温で20分間、1×PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で胚をポスト修正。 その後、1×PBS、0.1％Tween-20を室温で3分間、4回洗浄することによりパラホルムアルデヒド固定液を除去します。 プレハイブリダイゼーション緩衝液に後固定した胚を転送します。直接ストア-20℃でのプレハイブリダイゼーション緩衝液中の胚または、プローブのハイブリダイゼーションを進めます。 プローブのハイブリダイゼーション4. 移植胚をRTにプレハイブリダイゼーション緩衝液中で-20℃で保存しました。 2.0ミリリットルmicrotubにプレハイブリダイゼーション緩衝液中の胚を配布エス。 最小で30分間、プレハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で胚サンプルを事前にハイブリダイズします。 注意：プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションのために水浴を使用する手順。プレハイブリダイゼーションの間に三アンチセンスRNAプローブと異なる遺伝子転写産物に対する各特定を組み合わせ、異なるハプテンで標識することによりプローブミックスを準備する時間があります。 プローブミックスを得るために、100μlのハイブリダイゼーション緩衝液（50％容量/容量脱イオン化ホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlの中に一緒に所望の各元ハプテン標識アンチセンスRNAプローブの（通常6μlに1μlの間の）適切な量を追加しますヘパリンナトリウム塩、0.1％体積/体積のTween-20を、5 mg / mlのトルラRNA、5％重量/容積デキストランサルフェート）。 注意：硫酸デキストランの添加は任意です。 5分間80℃のヒートブロック中でアンチセンスRNAプローブミックスを変性させます。その後65℃に直接変性したプローブミックスを転送します。 プレハイブリダイゼーションの大部分を除去胚サンプルからバッファリングし、変性プローブ​​ミックスを追加します。 胚サンプルは65℃でミックスO / Nをプローブにハイブリダイズしてみましょう。 注：55℃、65℃の間の温度範囲は、日常的に、ハイブリダイゼーション、前後のハイブリダイゼーション工程のために使用されています。 65℃でのハイブリダイゼーションは、最も厳しい条件を提供し、より低い温度を使用するときに、背景の問題の場合に推奨されます。バックグラウンドの問題がない場合は、55℃でハイブリダイゼーションを強化信号強度および改善された胚の完全性の利点を提供する、推奨されます。 次の朝、最初に彼らが時間内に正確な温度に加熱されることを確認するために、65℃にストリンジェンシーの洗浄溶液を移します。 予め温めておいた2 mlを含有する12ウェルプレートのインサートに2.0ミリリットルのマイクロチューブから胚とのハイブリダイゼーションプローブミックスを転送ハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（2×SSC、0.1％のTween-20で50％ホルムアミド）。 EMを含む12ウェルプレートを置きオーブンでbryoサンプルと65℃で20分間インキュベートします。 2 mlの新たなハイブリダイゼーション洗浄バッファーに転送胚試料および65℃で20分間インキュベートします。もう一度この手順を繰り返します。 一度、2×SSC、0.2×SSC、0.1％のTween-20中の0.1％Tween-20を3回で、65℃で20分間の洗浄によって過剰のプローブを削除します。 PBS、0.1％Tween-20を室温で1倍する胚サンプルを転送します。 室温で少なくとも30分間ブロッキング緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20で8％のヒツジ血清）で胚を培養します。 ハプテン標識プローブの5抗体の検出注：すべての3つの異なって標識されたプローブの同時ハイブリダイゼーションとは対照的に、各プローブは、抗体インキュベーションおよび染色の別個のラウンドで次々と検出されます。したがって、各検出ラウンドで唯一つの抗体が使用される（抗ジゴキシゲニンAPまたは抗フルオレセイン-APまたは抗ビオチンAPのいずれか）。 STEPの間で選択します5.1.3に5.1.1と検出されるべきハプテンラベルに応じて適切な抗体希釈を準備を進めます。 注：異なる標識プローブの連続的検出のために、別の抗ハプテン抗体は、各検出周期において適用されます。 ブロッキング緩衝液で4000：フルオレセイン標識プローブの検出のために抗フルオレセイン-APコンジュゲート1を希釈します。 ブロッキング緩衝液中に4000：ジゴキシゲニン標識プローブの検出のために抗ジゴキシゲニンAPは1コンジュゲート希釈します。 ブロッキング緩衝液で4000倍に希釈したビオチン標識プローブの検出のために1で抗ビオチン-APコンジュゲート溶液を調製。 室温で3〜4時間のために選択された抗ハプテン-AP溶液中で胚をインキュベートします。また、4℃でO / Nインキュベートします。同時にすべての3つの抗体を適用しないでください。 非結合抗体を除去するために室温で4時間15分間、1×PBS、0.1％のTween-20で胚を洗浄します。 緩衝系を変更することでしたTNTでのRTでのH 2回15分（8.0 0.1 Mトリス-HCl、0.1 MのNaCl、0.1％のTween-20）。 6.アルカリホスファターゼ発色染色抗体検出に続いて（ 表1参照 ）6.1.4にステップ6.1.1のいずれかを選択し、所望の色信号を得るためにアルカリフォスファターゼ発色性染色反応の一つに進みます。検出の各ラウンドの異なる発色基質の反応は、他の色の各転写パターンを強調するために適用されます。 ファストレッド染色 TT8.2で15分（0.1 Mトリス塩酸pH8.2の、0.1％のTween-20）のための胚を2回洗浄します。 胚を洗浄しながら、ファストレッドTR / NAMPアルカリホスファターゼ基質錠セットからファストレッド染色液を準備します。 1ミリリットルの蒸留水に設定タブレットからバッファタブレットを溶解し、0.1Mトリス塩酸pHが8.2を取得するためにボルテックスして混合します。 準備されたTにファストレッドTR / NAMPタブレットをドロップRISファストレッド染色溶液を得るためにボルテックスすることによって緩衝液に溶解します。 0.2μmのシリンジフィルターを通して非溶解粒子からのクリアファストレッド染色液。 ファーストブルー染色洗浄液を新鮮SB8.2染色緩衝液（0.1 Mトリス-HCl pHを8.2、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、0.1％のTween-20）で15分間2回胚。 胚を洗浄しながら、50mgの（DMF中）/ mlのファーストブルーBBおよび50 mg / mlのナフトールリン酸（DMSO中）のストック溶液からのファーストブルー染色液を調製。 たてSB8.2では0.5mg / mlのファーストブルーBB溶液を調製。 たてSB8.2で0.5 mg / mlので別々ナフトールリン酸溶液を調製。 ボルテックスで一定の混合下でファーストブルーBB溶液に準備されたナフトールリン酸溶液を添加滴下。得られた最終の使用濃度は、両方の基板コンポーネントの0.25 mg / mlです。 注：別のファーストブルー/ナフトールphosp憎悪の組合せ（表1を参照）は、異なる色合いをもたらします。 BCIP / NBT染色洗浄液を新鮮SB9.5染色緩衝液（0.1 Mトリス-HCl pHを9.5、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、0.1％のTween-20）で15分間2回胚。 purpleblue発色性信号のために、新たに1μlのレバミゾール、3.5μlのBCIPとSB9.5の染色緩衝液1ml当たり4.5μlのNBTを追加することにより、BCIP / NBT染色液を調製し、よく混ぜます。 INT染色新鮮SB9.5の染色緩衝液中で15分間胚を2回洗浄します。 yellowbrown発色性信号のために、新たに1μlのレバミゾール、5μlのマゼンタ・フォスとSB9.5の染色緩衝液1ml当たり5μlのINTを追加することによって、INT染色液を調製し、よく混ぜます。 注：または7.5μL/ mlのBCIP / INTすぐに使用染色液を使用しています。 染色反応転送胚サンプルについて24ウェルプレートに。暗闇の中で選択した染色溶液400μlの各サンプルをインキュベートします。 実体顕微鏡下で開発を通知時折監視します。所望の信号強度が得られ、有意なバックグラウンドシグナルが観察される前に、染色反応を停止します。 発色反応を停止するには、転送は、ウェル当たり2ミリリットルのTNTを含む12ウェルプレートのインサートに胚を染色しました。 TNTで染色された胚を2回洗浄します。 残留基板を除去するために、胚を室温で1×PBS、0.1％のTween-20で10分間、2回洗浄します。 7.抗体の取り外し/アルカリホスファターゼの不活化 RTで10分間（グリシン-HCl pHを2.2、0.1％Tween-20を0.1 M）の抗体を除去し、低pHの停止溶液2ml中でインキュベートすることによりアルカリホスファターゼを不活性化します。 RTで1×2mlのPBS、0.1％のTween-20で1分間すすぎます。 1×PBS中で3分間3回洗浄し、0.1％Tween-20をRTで。 8.第二の検出ラウンド第二の転写物の分布パターンを検出するために第二のハプテン標識を標的とする抗体-APコンジュゲートを使用してハプテン標識プローブ（ステップ5.4から5.1）の抗体検出を進めます。 アルカリフォスファターゼ発色性染色（ステップ6.5から6.1）（利用可能な色は 、表1を参照）、第1の検出ラウンドで使用されるものに対照的な色を生成する基質の組み合わせを適用することを実行します。 7.3にステップ7.1で説明したように、第2の抗体-APコンジュゲートを除去します。 9.第3検出ラウンド第三の転写物の分布パターンを検出するために、第三のハプテン標識に特異的な抗体-APコンジュゲートを用いてハプテン標識プローブ（5.4 STEP 5.1）の抗体検出を進めます。 アルカリフォスファターゼ発色性染色（ステップ6.5から6.1）APなかった基質の組み合わせを適用することを実行します前回の検出ラウンドでプライ。色は前の2つの検出ラウンドのものと区別することは容易に沈殿生成発色反応を選択してください（色の選択については表1を参照）。 10.取付け・イメージング PBS中の30％グリセロールに適切に染色された胚を移し、胚が完全にグリセロール溶液に浸漬されるまでインキュベートします。彼らは底に沈むとき、彼らは十分に平衡化されています。 移植胚のH 2 O中の 70％グリセロールにし、室温で平衡化しましょう。染色された胚を、4℃で70％グリセロール中に保存することができます。 取り付けのために、ピペットは、オブジェクトのスライドに、スライド（ 図3）に接着スペーサを触れることなく、70％のグリセロール液滴で胚を染色しました。カバースリップを適用します。 ビューは、解剖顕微鏡下で胚をマウントしました。胚が所望の方向に回転するように、適用されるカバースリップを移動します。 正しく観察微分干渉コントラスト光学系を有する化合物の顕微鏡下での高解像度（20X、40X対物レンズ）で配向胚。 デジタルカラーカメラで画像をキャプチャし、デジタルストレージデバイスに保存します。