Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em> In Situ</em> Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em> Drosophila</em> Embriyolar

In vitro transkripsiyon RNA probların 1. Etiketleme RNaz içermeyen koşullar altında 1.5 ml'lik bir mikrotüp in vitro transkripsiyon reaksiyonu birleştirin: 10,5 ul DEPC ile muamele edilmiş, H 2, O, 4,0 ul 5x transkripsiyon tamponu, 1.0 ul DEPC işlenmiş, H2O içinde (1 ug) linearize saflaştırılmış kalıp DNA, 1,3 ul NTP karışımı, 0.7 ul hapten ile etiketlenmiş UTP, 0.5 ul RiboLock RNA inhibitörü, 2,0 ul RNA polimeraz. Not: Nihai reaksiyon hacmi 20 ul olduğunu. Şablonun promotör sekansı kullanımı T7 bağlı olarak, in vitro transkripsiyon için T3 veya SP6 RNA polimeraz (17 referans bakınız). RNA probu için etiket olarak digoxigenin-11-UTP biyotin-16-UTP veya floresan 12-UTP seçin. Daha fazla ayrıntı için, Tartışma Hapten-etiket ve prob konsantrasyonları tartışma bakın. Transkripsiyon reaksiyonu karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. Uyarlamak edelim37 ° C de 3 saat karıştırıldı. Şablon DNA uzaklaştırılması için transkripsiyon reaksiyonu 1 ul Rnaz içermeyen Dnaz I ekleyin, iyice karıştırılmakta ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. DEPC arıtılmış H2O 200 ul örnek hacmi ile ayarlayın. Etiketli RNA prob çökeltilmesi için 100 ul (0.5 hacim) 7.5 M amonyum asetat ve 600 ul (3 hacim) etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Bu adi nükleotidlerin istenmeyen yağış neden olabilir, buz gibi soğuk etanol kullanmayın. 20 ° C'de 30 dakika maksimum hızda (20,800 xg) bir sıcaklığı kontrol edilen santrifüj transkribe RNA dönerler. Dikkatle süpernatant aspire. 20 ° C'de 10 dakika boyunca 20.800 x g'de 70%, oda sıcaklığında etanol ve santrifüj ile elde edilen pelet yıkayın. Süpernatantı ve yanlışlıkla gevşek pelet aspire için dikkatli olun. RT'de bir kaç dakika için açılan kapaklı mikrotüp pelet hava kurumasını bekleyin. DisDEPC ile muamele edilmiş H2O 100 ul 'de elde edilen pelet çözme -20 ° C'de 300 ul ön hibridizasyon tamponu ekleyin (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA) ve mağaza . Problar -20 ° C'de saklandı uzun süreli olabilir. Not: 100 ul hibridizasyon tamponu içinde yeni transkribe prob seyreltik 3 ul hapten-işaretli RNA probu bir birinci test için DİLERİZ deney için nihai konsantrasyon elde edildi. Uçlar kullanılması Embriyo Örneklerinin 2. işlenmesi Not: farklı inkübasyon adımları embriyolar işlenmesi için mikrotüpler veya çok oyuklu plakaları kullanılarak yanlışlıkla çözeltilerin değişimi sırasında onları aspire embriyoların önemli miktarlarda kaybetme riskini taşımaktadır. Bu kaybı önlemek için, prosedür yoluyla embriyo örnekleri taşıyan (örneğin Netwell ekler gibi) sepet kullanmak yararlı olabilir. Bu polistiren olanEmbriyolar işlem sırasında dinlenme hangi alt (Şekil 2A) bir polyester mesh ile SERT. DİLERİZ prosedürü embriyolar işlem, bir 12 oyuklu plaka (Şekil 2B) uçlar bir araya getirmek ve her bir oyuğa, uygun 2 ml solüsyon ilave edin. Mavi ucunu kullanarak ekler içine embriyolar pipetle. Tüm embriyolar sıvı batık emin olun. Kuluçka süresi yerde bir sonraki aşama için çözeltisi ile doldurulmuş bir başka 12-çukurlu plaka içinde embriyo ihtiva eden ekler olduğunda. (Şekil 2C) birbirinden (Şekil 2D), bir solüsyonuna bir kerede 12 numuneye kadar transfer taşıyıcıları ve tutamaçları kullanın. Not: gerekli hacmini azaltmak boyama reaksiyonları (Basamak 6.2) ön-hibridizasyon / hibridizasyon adımları (Basamak 4.1) ve 24-kuyucuklu levhalar için 2,0 mi mikrotüpler kullanın. Melezleme ve boyama reaksiyonları 100 hacimlerinde yapılır1, l, sırasıyla 400 ul. Hibridizasyon için Embriyolar 3. hazırlanması , Dechorionate, toplayın düzeltmek ve standart prosedürler 14,18 ile embriyolar devitellinize. Hazırlanan embriyolar rutin -20 ° C'de metanol içinde depolanır. Embriyolar transfer oda sıcaklığına in situ melezleme için kullanılmaktadır ve oyuk başına 2 ml metanol ile dolu bir 12-yuvalı plakanın ekler halinde dağıtmak için. RT'de azalan metanol dizi embriyolar rehidrate. (I) 1 x PBS içinde 1 x PBS, (ii)% 50 metanol içinde% 75 metanol, Tween-20, (iii) 1 x PBS içinde% 25 metanol,% 0.1 Tween-20 (iv% 0.1: 3 dakika içinde için embriyolar her inkübe ) 1x PBS,% 0.1 Tween-20 (v) PBS 1x,% 0.1 Tween-20. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS'de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar ön sabitleyin. Oda sıcaklığında 1 x PBS'de 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için 4 kez yıkanmasından Fiksatif çıkarın. Bu arada Çözülme ve proteinaz K ve glisin çalışma çözümler hazırlar. <li> Taze proteinaz K Permeabilize embriyolar 1x PBS içinde, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 için 3 dakika boyunca (50 ug / ml ila 10 ug / ml). Not: proteinaz K tedavisi embriyo tespitin gücüne dengelenir. Ön sabitleme adımı (3,4) mevcut değildir, örneğin, yumuşak bir proteinaz K tedavisi uygulanabilir. % 0.1 Tween-20, oda sıcaklığında 2 mg / 1 x PBS içinde mi, glisin, iki 1 dakika durulama ederek reaksiyonu durdurun. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS'de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar sonrası sabitleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 X PBS içinde 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için yıkama dört kez paraformaldehit fiksatif çıkarın. Aktarım sonrası sabit embriyolar ön hibridizasyon tampon. Ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde mağazası embriyolar -20 ° C'de ya da doğrudan amacı ile sondaların hibritleşmesi devam edin. Sondalar 4. Melezleme Embriyolar transfer oda sıcaklığına ön hibridizasyon tamponu içinde -20 ° C'de saklandı. 2,0 ml microtub içine önceden hibridizasyon tamponu içinde embriyolar dağıtınes. En az 30 dakika için ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde 65 ° C 'de embriyo örnekleri önceden hibridize. Not: Ön melezleştirme ve melezleştirme için, bir su banyosu kullanılmıştır adımları tekrarlayın. Ön melezleme sırasında üç antisens RNA probları, her biri farklı bir gen transkriptinin için özel ve farklı bir haptenle işaretlenmiş kombine etmek üzere prob karışımı hazırlamak için zaman vardır. Prob bir karışım elde etmek için, 100 ul hibridizasyon tamponu (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml her biri istenen, özgün hapten-etiketli antisens RNA probu (genellikle 1 ul ul 6 arasındaki) ile birlikte uygun miktarlarda ilave heparin, sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA,% 5 ağırlık / hacim, dekstran sülfat). Not: dekstran sülfat ilavesi tercihe bağlıdır. 5 dakika boyunca 80 ° C'de bir ısı blokunda antisens RNA probu karışımı denatüre. Daha sonra 65 ° C'ye kadar, doğrudan denatüre prob karışımı aktarın. Ön-hibritleme en kaldırEmbriyo örneklerinden tampon ve denatüre prob karışımı ekleyin. Embriyo örnekleri 65 ° C 'de karışım O / N prob hibridize olsun. Not: 55 ° C ve 65 ° C arasında değişen sıcaklıklar rutin melezleştirme öncesi ve sonrası hibridizasyon adımları için kullanılır. 65 ° C'de hibridizasyon, en sıkı koşullar sağlar ve daha düşük sıcaklıklar kullanılarak, arka plan sorunlar durumunda önerilir. Herhangi bir arka plan sorunları geliştirilmiş sinyal kuvveti ve iyileştirilmiş embriyo bütünlüğü avantajını sağlar, 55 ° C'de melezleştirme tavsiye edilir, varsa. Sonraki sabah ilk emin zaman içinde doğru sıcaklığa ısıtılır olduğundan emin olmak için, 65 ° C'ye kadar bir sertlik yıkamayı çözüm aktarın. 2 ml önceden ısıtılmış hibridizasyon yıkama tamponu ihtiva eden bir 12-yuvalı plakanın uçlar halinde 2,0 ml mikrotüpler embriyolarında aktarma melezleştirme prob karışımı (2 x SSC içinde% 50 formamid,% 0.1 Tween-20). Onları içeren 12-plaka koyunbir fırın içinde bryo örnekler ve 65 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. 2 mi, yeni hibridizasyon yıkama tamponu transfer embriyo örnekler ve 65 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. Bir kez daha bu adımı yineleyin. 2 x SSC içinde, bir kez 65 ° C'de 20 dakika yıkama yapılmıştır aşırı prob çıkarın,% 0.1 Tween-20 ve 0.2 x SSC içinde üç kez,% 0.1 Tween-20. PBS, Tween-20 oda sıcaklığında% 0.1 1x embriyo örnekleri aktarın. Oda sıcaklığında en az 30 dakika blokaj tamponunda (1x PBS,% 0.1 Tween-20 içinde% 8 serumu) embriyolar inkübe edin. Hapten etiketli Sondalar 5. Antikor tespiti Not: Tüm üç farklı işaretli prob eşzamanlı hibridizasyon aksine, her bir prob bir antikor inkübasyon ve lekeleme ayrı mermi birbiri ardına tespit edilir. Bu nedenle, her bir algılama tur tek antikoru kullanıldığında (anti-digoksijenin-AP ya da anti-floresin-AP ya da anti-biyotin-AP) oluşur. STEP arasında seçim5.1.1 5.1.3 ve tespit edilecek olan hapten-etiketi göre uygun bir antikor seyreltme hazırlanması ile devam etmek. Not: farklı etiketli problar sıralı saptanması için, bir anti-hapten antikor her bir algılama döngüsü uygulanır. Bloke edici tampon içinde 4000:, floresein-işaretli prob algılama seyreltik için anti-floresan AP 1 konjugatlar. Bloke edici tampon içinde 4000: a digoksigenin-etiketli prob tespiti seyreltik için, anti-digoksijenin-AP 1 konjugatlar. Bloke edici tampon içinde 4000 seyreltme: bir biyotin-etiketli prob saptanması için, bir 1 de bir anti-biyotin-AP konjugat solüsyon hazırlanır. Oda sıcaklığında 3 saat 4 için, seçilmiş anti-hapten-AP çözeltisi embriyolar inkübe edin. Seçenek olarak ise, O / N 4 ° C'de inkübe edin. Aynı anda üç antikorları sürmeyin. Bağlanmamış antikorların çıkarılması için 1 x PBS, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 kat 4, 15 dakika ile embriyolar yıkayın. Tampon sistemlerini değiştirmek olduTNT oda sıcaklığında H iki kez 15 dakika (8,0 0.1 M Tris-HCI pH 0.1 M NaCl,% 0.1 Tween-20). 6. Alkalin Fosfataz Kromojenik Boyama Antikor bulgulama takiben (bakınız Tablo 1) 6.1.4 STEP 6.1.1 arasında seçim ve istenilen renk sinyali elde etmek için alkalin fosfataz kromojenik boyama reaksiyonlar bir ile devam eder. Tespit, her tur için farklı bir kromojenik alt tabaka reaksiyon, başka bir renk, her transkript örneğini vurgulamak için uygulanır. Hızlı Kırmızı Boyama TT8.2 15 dakika boyunca (0.1 M Tris-HCI pH 8.2,% 0.1 Tween-20) için embriyolar, iki kez yıkayın. Embriyoların yıkarken, Fast Red TR / NAMP Alkalen Fosfataz Yüzey Tablet Set Hızlı Kırmızı boyama solüsyon hazırlanır. Damıtılmış su, 1 ml ayarlanır tabletin bir tampon tableti çözülür ve 0.1 M Tris-HCl, pH 8,2 elde edilir vorteks karıştırın. Hazırlanan T içine Fast Red TR / NAMP tablet Bırakris tampon ve Hızlı Kırmızı boyama çözüm elde etmek için vorteks çözülür. 0.2 um'lik bir şırınga filtreden geçirilmiştir olmayan çözülmüş parçacıklarından açık Hızlı Kırmızı boyama çözeltisi. Hızlı Mavi Boyama Taze SB8.2 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 8.2, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20). Embriyoların yıkarken 50 mg / DMF () mi Fast Blue BB ve (DMSO içinde) 50 mg / ml naftol fosfat stok çözeltilerinden hızlı mavi ile boyanmamış solüsyon hazırlanır. Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml'lik bir Fast Blue BB solüsyon hazırlanır. Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml'de ayrı naftol fosfat solüsyon hazırlanır. Bir girdap ile sabit karıştırma altında Fast Blue BB çözeltisi içine hazırlanmış naftol fosfat çözeltisi ilave ilave edildi. Ortaya çıkan son çalışma konsantrasyonu, hem alt tabaka bileşenleri için ml 0.25 mg / olduğunu. Not: Farklı Hızlı Mavi / naftol fosfonathate kombinasyonları, değişik renk tonları (Tablo 1 e bakınız) ile sonuçlanır. BCIP / NBT Boyama Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 9.5, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20). Bir purpleblue kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 3,5 ul BCIP ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml'si başına 4.5 ul NBT ekleyerek BCIP / NBT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın. INT Boyama Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın. Bir yellowbrown kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 5 ul Kırmızı-Fos ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml'si başına 5 ul INT ekleyerek INT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın. Not: Alternatif olarak 7,5 ul / ml BCIP / INT hazır kullanım boyama çözeltisi kullanılır. Boyama reaksiyon transferi embriyo örnekleri içinBir 24-yuvalı plaka. Karanlıkta seçilen boyama çözeltisi 400 ul her bir örnek inkübe edin. Bir stereomikroskop altında gelişimini sinyal bazen izleyin. Istenen sinyal gücü elde edilmiş ve önemli bir arka plan sinyali gözlenir önce zaman boyama reaksiyonu durdurun. Kromojenik reaksiyonu durdurmak oyuk başına 2 ml'lik TNT ihtiva eden bir 12-çukurlu plaka içinde uçlar lekeli embriyolar aktarın. TNT lekeli embriyolar iki kez durulayın. 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez yıkanır embriyolar, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 bakiye substratı temizlemek için. 7. Antikor Temizleme / Alkalen Fosfataz İnaktivasyonu Antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika için düşük pH, durdurma çözeltisi (0.1 M glisin-HCI pH 2.2,% 0.1 Tween-20) 2 ml kuluçkalama ile alkalin fosfataz etkisiz hale getirirler. Oda sıcaklığında 1 x 2 ml PBS,% 0.1 Tween-20 ile 1 dakika için durulayın. 1 x PBS içinde 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın,% 0.1 Tween-20 ilave edilir. 8. İkinci Algılama Yuvarlak İkinci kopyanın dağılımını saptamak için ikinci hapten-etiket karşı hedeflenen antikor AP eşleniklerini kullanarak hapten-etiketli problar (STEP 5.4 5.1) antikor tespiti ile devam edin. Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) (mevcut renkler Tablo 1'e bakınız için) ilk saptama turunda kullanılan birine zıt renk üreten bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirin. 7.3 ADIM 7,1 de tarif edildiği gibi ikinci antikor-AP konjugatı çıkarın. 9. Üçüncü Algılama Yuvarlak Üçüncü bir transkriptin dağılımını tespit etmek için, antikor-AP 3 hapten-etiket için belirli bir konjugatlar kullanılarak hapten-işaretli prob antikor tespiti (Basamak 5.4 5.1) devam edin. Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) ap olmayan bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirinBir önceki algılama turlarında uğraşıyorlardı. Bir renk önceki iki algılama mermi olanlardan ayırt etmek kolay çöktürmek üreten kromojenik reaksiyonu seçiniz (renk seçimi için bakınız Tablo 1). 10. Montaj ve Görüntüleme PBS içinde% 30 gliserol düzgün lekeli embriyoların transferi ve embriyoların tam gliserol çözeltisi batırılmış kadar kuluçkaya yatmaktadır. Onlar dibe batar Onlar iyi dengelenir. H 2 O% 70 gliserol embriyo transferi ve oda sıcaklığında dengeye izin. Lekeli embriyolar 4 ° C'de% 70 gliserol içinde saklanabilir. Montaj için pipet bir nesne slayt üzerine ve slayt (Şekil 3) yapıştırılmış aralayıcıları dokunmadan% 70 gliserol damlacık embriyolar boyandı. Kapak kayma uygulayın. Görünüm bir mikroskop altında embriyolar monte edilmiş. Embriyolar istenilen açıda döndürmek, böylece uygulanan kapak kayma taşıyın. Düzgün gözlemleyinDiferansiyel Girişim Kontrast optik ile bileşik mikroskop altında yüksek çözünürlüklü (20X, 40X hedefleri) yönlendirilmiş embriyolar. Bir dijital renkli kamera ile görüntüler yakalayın ve dijital depolama aygıtında kaydedin.