Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em> На месте</em> Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em> Drosophila</em> Эмбрионы

1. Маркировка РНК-зондов с In Vitro транскрипции Соберите в пробирке реакция транскрипции в микропробирку 1,5 мл под РНКазы условиях: 10,5 мкл DEPC лечение Н 2 О, 4,0 мкл 5x буфера транскрипция, 1,0 мкл (1 мкг) линеаризовали, очищенная ДНК-матрицы в DEPC обработанной H 2 O, 1.3 мкл NTP смесь, 0,7 мкл гаптен- помечены UTP, 0,5 мкл РНК RiboLock ингибитор, 2,0 мкл РНК-полимеразы. Примечание: Конечный объем реакции 20 мкл. В зависимости от последовательности промотора Т7 использования шаблона, Т3 или SP6 РНК-полимеразы для транскрипции в пробирке (см ссылки 17). Выберите дигоксигенином-11-UTP, биотин-16-UTP или флуоресцеина-12-UTP в качестве метки для РНК зонда. Для более подробной информации см обсуждение гаптен- этикеток и концентрации зондовых в дискуссии. Смешайте реакции транскрипции и спин вниз в ближайшее время. Давайте расшифроватьв течение 3 ч при 37 ° С. Добавить 1 мкл РНКазы ДНКазы I в реакции транскрипции для удаления матричной ДНК, хорошо перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С. Отрегулируйте с DEPC обработке H 2 O объем выборки 200 мкл. Добавить 100 мкл (0,5 объема) ацетат 7,5 М аммония и 600 мкл (3 т) этанола, чтобы осадить меченой РНК зонд. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Не используйте ледяной этанола, так как это может привести к нежелательному осаждению без образования юридического лица нуклеотидов. Спин вниз транскрипции РНК в контролируемой температурой центрифуге при максимальной скорости (20800) XG в течение 30 мин при температуре +20 ° С. Тщательно аспирата супернатант. Промыть Полученный осадок с 70% этанола при комнатной температуре и центрифуге при 20,800 х г в течение 10 мин при + 20 ° С. Удалить супернатант, и будьте осторожны, чтобы случайно не потерять аспирации осадок. Пусть воздух сухой осадок в микропробирку с открытой крышкой в ​​течение нескольких минут при комнатной температуре. Дисрешить Полученный осадок в 100 мкл DEPC обработанных H 2 O. Добавить 300 мкл предварительно гибридизации буфер (50% об / об деионизированной формамида, 5x SSC, 50 мкг / мл гепарина натриевую соль, 0,1% об / об Твина-20, 5 мг / мл Torula РНК) и хранят при -20 ° C , Зонды могут быть долгосрочным хранили при -20 ° С. Примечание: для первого испытания вновь транскрипции зонда разбавленной 3 мкл гаптен-меченой РНК зонд в 100 мкл буфера для гибридизации, чтобы получить конечную концентрацию для эксперимента желание. 2. Обработка эмбриона образцов с использованием вставки Примечание: Использование микротрубки или нескольких пластин также для обработки эмбрионов через различные этапы инкубации несет риск потери значительных количеств эмбрионов, случайно аспирационных их при обмене решений. Чтобы избежать этих потерь, это может быть полезно использовать корзины (например, Netwell вставки) для проведения образцы эмбрионов с помощью процедуры. Эти полистирола входные с полиэфирной сетки в нижней (рис 2А), на котором эмбрионы отдохнуть во время обработки. Для обработки эмбрионов в порядке желание, собрать вставки в 12-луночного планшета (рис 2B) в и добавьте 2 мл соответствующего раствора в каждую лунку. Внесите эмбрионов в вставок синий кончик. Убедитесь, что все эмбрионы погружаются в жидкости. Когда время инкубации в течение месте эмбрион, содержащий вставки в другой 12-луночный планшет, который заполнен раствором на следующей стадии. Использование носителей и ручки (фиг.2С) передавать до 12 образцов одновременно от одного решения к другому (фиг 2D). Примечание: Для того, чтобы уменьшить требуемые объемы, использовать 2,0 мл микропробирки для шагов до гибридизации / гибридизации (см ШАГ 4.1) и 24-луночных планшетах для окрашивания реакций (шаг 6.2). Гибридизации и окрашивания реакции проводят в объемах 1001; л и 400 мкл, соответственно. 3. Подготовка эмбрионов для гибридизации Сбор, dechorionate, исправить, и devitellinize эмбрионов с использованием стандартных процедур 14,18. Подготовленные эмбрионы хранятся обычно в метаноле при -20 ° С. Эмбрионы передачи, которые будут использоваться для в гибридизация до комнатной температуры и распределяют в вставками 12-луночного планшета, заполненной 2 мл метанола на лунку. Увлажняет эмбрионов через убывающей метанола серии при комнатной температуре. Инкубируйте эмбрионов каждый раз в течение 3 мин в: (I) 75% метанола в 1X PBS (II) 50% метанола в 1x PBS, 0,1% Tween-20 (III) 25% метанола в 1x PBS, 0,1% Tween-20 (IV ) 1X PBS, 0,1% Tween-20 (V) 1X PBS, 0,1% Tween-20. Предварительно исправить эмбрионов в 4% параформальдегида в PBS 1x в течение 20 мин при комнатной температуре. Удалить фиксатором на 4 промывок в течение 3 мин в 1x PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. Между тем таять и подготовить протеиназы К и глицина рабочих растворов. <li> Эмбрионы проницаемыми в свежей протеиназы К (10 мкг / мл до 50 мкг / мл) в PBS, 1x 0,1% Tween-20 в течение 3 мин при комнатной температуре. Примечание: протеиназой К сбалансирован с силой эмбриона фиксации. Например, если этап предварительной фиксации (3,4) опущен, мягче протеиназы К обработка может быть применена. Остановить реакцию двух промывок 1 мин в 2 мг / мл глицина в 1x PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. После фиксации эмбрионов в 4% параформальдегид в PBS 1x в течение 20 мин при комнатной температуре. Впоследствии удалить параформальдегида фиксатором промывкой четыре раза в течение 3 мин в 1X PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. Фиксировали эмбрионы передачи предварительно гибридизации буфер. Эмбрионы Хранить в предварительно гибридизации буфера при -20 ° С или непосредственно приступить гибридизации зондов. 4. Гибридизация зондов Эмбрионы передачи хранили при -20 ° С в предварительно гибридизации буфера до комнатной температуры. Распределить эмбрионов в предварительно гибридизации буфера в 2,0 мл microtubES. В течение 30 мин, как минимум, предварительно гибридизуются образцы эмбрионов при 65 ° С в предварительно гибридизации буфера. Примечание: Для предварительной гибридизации и гибридизации шаги водяной бане используется. Во время предварительной гибридизации есть время, чтобы подготовить смесь зонда путем объединения до трех антисмысловой РНК зондов, каждый конкретный для другого транскрипта гена и помечены с другим гаптена. Чтобы получить смесь зонда, сложить соответствующие количества (обычно от 1 мкл до 6 мкл) каждого желаемого оригинального гаптен-меченых антисмысловой РНК-зонда в 100 мкл гибридизации буфера (50% об / об деионизированной формамида, 5x SSC, 50 мкг / мл гепарина натриевую соль, 0,1% об / об Твина-20, 5 мг / мл РНК Torula, 5% вес / объем сульфата декстрана). Примечание: Добавление декстрансульфата является необязательным. Денатурации смеси зонда антисмысловой РНК в нагревательный блок при 80 ° С в течение 5 мин. Впоследствии передачи денатурированный зонд смесь непосредственно до 65 ° С. Удалить большую часть предварительной гибридизациибуфер из образцов эмбриональных и добавьте денатурированный смесь зонда. Пусть Образцы эмбриона гибридизации с зонд смесь O / N при 65 ° С. Примечание: температурах в диапазоне от 55 ° C и 65 ° C, которые обычно используются для гибридизации, до и после гибридизации шагов. Гибридизации при 65 ° С обеспечивает наиболее жесткие условия и рекомендуется при фоновых задач при использовании более низких температур. Если нет фоновые задачи, гибридизацию при 55 ° С рекомендуется, что обеспечивает преимущество улучшенной силы сигнала и улучшенной целостности эмбриона. На следующее утро, в первую передавать жесткость промывные растворы до 65 ° С, чтобы убедиться, что они нагреваются до нужной температуры во времени. Передача гибридизации смесь зонд с эмбрионов из микропробирок 2,0 мл в вставками 12-луночного планшета, содержащую 2 мл предварительно нагретого буфера гибридизации стирки (50% формамид в 2 х SSC, 0,1% Твин-20). Поместите 12-луночного планшета, содержащего ЭМОбразцы БРСМ в духовке и инкубировать в течение 20 мин при 65 ° С. Образцы Перенос эмбрионов в 2 мл буфера гибридизации нового стирки и инкубировать в течение 20 мин при 65 ° С. Повторите этот шаг еще раз. Удалить излишки зонд 20 мин стирок при температуре 65 ° С, один раз в 2 х SSC, 0,1% Твин-20 и три раза в 0,2 х SSC, 0,1% Твин-20. Передача образцов эмбрион 1x PBS, 0,1% Твин-20 при комнатной температуре. Инкубируйте эмбрионов в блокирующем буфере (8% овечьей сыворотки в 1x PBS, 0,1% Tween-20) в течение не менее 30 мин при комнатной температуре. 5. Выявление антител гаптен-меченых зондов Примечание: В отличие от одновременного гибридизации всех трех зондов разному маркированных, каждый зонд обнаружена одна за другой в отдельных этапов инкубации антител и окрашивания. Таким образом, в каждом раунде обнаружения используется только одно антитело (или анти-дигоксигенином AP или антифлуоресцентного-AP или анти-биотин-AP). Выбор между STEP5.1.1 5.1.3 и продолжить подготовку соответствующего разведения антитела в соответствии с гаптен-этикетки, который должен быть обнаружен. Примечание: В случае последовательного обнаружения разному меченых зондов, другой анти-гаптен-антитело применяется в каждом цикле обнаружения. Для обнаружения меченого флуоресцеином зонда разбавленной антифлуоресцентного-AP конъюгатов 1: 4000 в блокирующем буфере. Для обнаружения дигоксигенином меченного зонда разбавить анти-дигоксигенином А.П. сопрягает 1: 4000 в блокирующем буфере. Для обнаружения биотин-меченным зондом подготовить анти-биотин-AP раствор конъюгата в разведении 1: 4000 в блокирующем буфере. Инкубируйте эмбрионов в растворе выбранного анти-гаптен-AP от 3 до 4 ч при комнатной температуре. В качестве альтернативы, инкубировать O / N при 4 ° С. Не применять все три антитела одновременно. Для того чтобы удалить несвязанного антитела мыть эмбрионов с 1x PBS, 0,1% Tween-20 в 4 раза 15 мин при комнатной температуре. Чтобы изменить буферные системы былоч в два раза 15 мин при комнатной температуре в TNT (0,1 М Трис-HCl рН 8,0, 0,1 М NaCl, 0,1% Твин-20). 6. щелочной фосфатазы Хромогенный Окрашивание После обнаружения антител выбирать между STEP 6.1.1 6.1.4 и заполните один из щелочной фосфатазы хромогенными реакций окрашивания, чтобы получить желаемый цвет сигнала (см таблицу 1). Для каждого раунда обнаружения другой хромогенного субстрата реакции применяется для выделения каждого транскрипта шаблон в другой цвет. Быстрый Красный Окрашивание Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в TT8.2 (0,1 М Трис-HCl рН 8,2, 0,1% Твин-20). В то время как мытье эмбрионов, подготовить Быстрая Red окрашивания раствора из Fast Красный TR / NAMP субстрата щелочной фосфатазы таблетки Set. Растворите буферную таблетку из планшета установлен в 1 мл дистиллированной воды и перемешивают на вортексе, чтобы получить 0,1 М Трис-HCl рН 8,2. Оставьте Быстрая таблетку Красный TR / NAMP в подготовленную ТРИС буфер и растворить встряхиванием для получения быстрого Red решение окрашивания. Ясно быстрого Красный окрашивание раствора от не-растворенных частиц через фильтр в шприце 0,2 мкм. Быстрый Голубой Окрашивание Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB8.2 (0,1 М Трис-HCl рН 8,2, 0,1 М NaCl, 0,05 М MgCl 2, 0,1% Твин-20). При промывке эмбрионы, подготовить Fast Голубой красящий раствор из 50 мг / мл Быстрое Синий BB (ДМФА) в и 50 мг / мл фосфата нафтола (в ДМСО) маточных растворов. Свежий подготовить Быстрая Синий BB решение по 0,5 мг / мл в SB8.2. Свежий подготовить отдельный нафтол раствора фосфата в 0,5 мг / мл в SB8.2. По каплям добавляют подготовленную нафтол раствор фосфата в быстро Синий BB раствора при постоянном перемешивании с вихря. Полученную окончательный рабочий концентрация 0,25 мг / мл для обоих компонентов субстрата. Примечание: Different Быстрая синий / НАФТОЛ phospКомбинации ненависти привести в различных цветовых оттенков (см таблицу 1). BCIP / НБТ Окрашивание Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB9.5 (0,1 М Трис-HCl рН 9,5, 0,1 М NaCl, 0,05 М MgCl 2, 0,1% Твин-20). Для purpleblue хромогенным сигнала, недавно подготовить BCIP / NBT окрашивания решение, добавив 1 мкл левамизол, 3.5 мкл BCIP и 4,5 мкл NBT на мл буфера окрашивания SB9.5 и хорошо перемешать. INT Окрашивание Промыть эмбрионы два раза в течение 15 мин в свежем буфере окрашивания SB9.5. Для yellowbrown хромогенным сигнала, недавно подготовить INT окрашивания решение путем добавления 1 мкл левамизол, 5 мкл Magenta-Фос и 5 мкл INT на мл буфера окрашивания SB9.5 и хорошо перемешать. Примечание: Также можно использовать 7,5 мкл / мл BCIP / INT готов к использованию решение окрашивание. Для образцов эмбриональных окрашивание передачи реакцияв 24-луночный планшет. Инкубируют каждый образец в 400 мкл выбранного окрашивающим раствором в темноте. Монитор иногда сигнализировать развитие под стереомикроскопа. Остановить реакцию окрашивания, когда требуемая прочность сигнал получается и до наблюдается значительное фоновый сигнал. Чтобы остановить хромогенную реакцию, передавать окрашенные эмбрионы в вставками из 12-луночного планшета, содержащего 2 мл на лунку TNT. Промыть окрашенных эмбрионов два раза в тротиловом эквиваленте. Промыть эмбрионы два раза в течение 10 мин в 1 × PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре, чтобы удалить остатки субстрата. 7. Антитела удаления / инактивации щелочной фосфатазы Удалить антитела и инактивировать щелочную фосфатазу путем инкубации в 2 мл раствора с рН низкой останова (0,1 М глицин-HCl, рН 2,2, 0,1% Твин-20) в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть в течение 1 мин с 2 мл 1 × PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. Промыть 3 раза в течение 3 мин в 1X PBS, 0,1% Tween-20 при комнатной температуре. 8. Во-вторых обнаружения Круглый Для обнаружения картину распределения второго стенограммы продолжить обнаружения антитела гаптен-меченых зондов (шаг 5,1 до 5,4), используя антитело-AP конъюгатов, направленных против второго гаптен- этикетке. Выполните щелочной фосфатазы хромогенную окрашивание (STEP 6.1 до 6.5), применяя комбинацию подложки, который производит контрастный цвет на используемый в первом туре обнаружения (для цвета в наличии см таблицу 1). Удалить второе антитело-AP конъюгат, как описано в шаге 7.1 до 7.3. 9. В-третьих Обнаружение Круглый Для того чтобы обнаружить картину распределения третьего транскрипта, продолжить выявления антител гаптена-меченных зондов (шаг 5.1 до 5.4), используя антитело-AP конъюгаты, характерные для третьего гаптен-меткой. Выполните щелочной фосфатазы хромогенную окрашивание (STEP 6.1 до 6.5) применения комбинации материалов, что не было APкурсировали в предыдущих раундах обнаружения. Выберите хромогенную реакцию, которая производит цветной осадок легко отличить от предыдущих двух турах обнаружения (для выбора цвета см таблицу 1). 10. Монтаж и изображений Трансфер правильно окрашенных эмбрионов до 30% глицерина в PBS и инкубировать до эмбрионы полностью всасывается в растворе глицерина. Они хорошо уравновешенную, когда они опускаются на дно. Эмбрионы передачи до 70% глицерина в H 2 O, и пусть равновесие при комнатной температуре. Окрашенные эмбрионы могут быть сохранены в 70% глицерине при 4 ° С. Для монтажа, пипетки окрашенных эмбрионов в 70% глицерина капли на предметное стекло в и без касания прокладки приклеены к слайду (рисунок 3). Применить покровное. Посмотреть установлен эмбрионов при вскрытии микроскопом. Движение приложенной к покровным так, что эмбрионы вращаться в требуемом направлении. Соблюдайте правильноориентированные эмбрионы с высоким разрешением (20X, 40X цели) под микроскопом с соединением дифференциальных интерференционного контраста оптики. Захват изображения с цифровой цветной камерой и сэкономить на цифровые устройства хранения данных.