우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.
배아 발달하고 정확하게 상이한 유전자 시츄 서로 공간적 관계로 표현하는 방법을 정의하는 것이 필수적이다 형성기 중에 활성 유전자 조절 네트워크를 분석. 멀티 타겟 발색 전체 마운트 계내 혼성화 (MC-WISH)가 동일한 샘플 표본에 색 대조 상이한 mRNA의 종 특유의 시각화를 허용하기 때문에 크게 유전자 발현 패턴의 인스턴트 비교를 용이하게한다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현 도메인을 관련시키는 독특한 발현과 겹치는 위치를 정의하기 위해 제공한다. 제시된 프로토콜에서는 초파리 배아에서 다른 유전자의 mRNA 발현 패턴을 비교하기 위해 MC-WISH 절차를 설명한다. 세 RNA 프로브, 각각 다른 유전자에 특이하고 다른 합텐으로 표시까지, 배아 샘플에 동시에 혼성이어서 알칼리에 의해 감지북동 비색 면역 조직 화학 염색을 포스 파타 아제는 기반. 설명 절차는 여기에 초파리에 대한 자세한하지만, 제브라 피쉬의 배아와 동일하게 작동합니다.
현장 하이브리드 (ISH)에서 세포, 조직 및 생물 (1) 내의 형태 학적 맥락에서 감지 및 RNA 전 사체의 현지화에 대한 표준 방법입니다. ISH 절차에 의해 생성 된 신호는 일반적으로, 형광 및 발색 방사성 검출 시스템에 의해 가시화된다. 최근에는 형광 ISH에 상당한 기술적 진보 (물고기)의 2는 단일 분자 3,4 .WHILE까지 단일 셀 및 하위 세포 수준과 RNA를 시각화의 검출 및 RNA 발현의 정량을 허용 크게 향상 감도와 해상도를 결과 정교한 단일 분자 FISH 방법은보다 전문적인 응용 프로그램에 사용되는, 발색 ISH 연구 및 임상 진단의 현장 검출 방법의 일상적인 RNA로 널리 퍼져있다. 발색 검출을 위해 효소 침전 반응은 사이트에서 색상을 대조에 표시 제품을 생성하는 데 사용됩니다하이브리드 5. 이것은 RNA 시각화는 루틴 조직학 얼룩 및 형태학 컨텍스트와 결합 될 수있는 이점이 표준 명 시야 현미경으로 즉시 분명 갖는다. 또한,인가 색 기판은 다수의 영구 샘플 제제 5 얻어 지도록, 유기 및 / 또는 수성 매질에서 안정한 장착되어 석출물을 생성한다.
초파리에서 초기 ISH 프로토콜은 단면 한 재료 (6)에 성적 증명서 검출을 위해 방사성 동위 원소 표지 된 프로브를 적용했다. 이 조직 절편에서 전체 배아 또는 기관 시스템의 전체 전사 패턴을 재구성하는 것은 곤란하지만, 비 – 방사능 표지 된 프로브와 발색 ISH 절차의 적용은 가능한 전체 마운트 7 RNA 분포를 검출 전체적으로 할 수있다. 발색 ISH의 많은 변형이 존재하지만, 일반적인에서 현장 하이브리드 (위시) 프로토콜 HYB에서 전체 마운트ridized 합텐 표지 프로브는 항 합텐 항체 기자 효소에 결합하고 mRNA의 성적이 침전 발색에 의해 시각화에 의해 감지됩니다.
기자에 의해 생산 다르게 색 침전물의 팔레트는 알칼리성 포스파타제 (AP), 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (POD) 및 베타 – 갈 락토시다 (GAL) 하나에서 여러 대상의 특징 검출과 동일한 샘플 8-14을 허용 효소. 그러나, POD 효소 활성은 제한된 시간 기간 동안 지속하고 추가 (tyramide)는 신호 증폭 15 덜 풍부한 사체의 검출이 효소 어려울 수없이되도록 GAL 비색 반응은 다소 덜 민감하다. 이와는 대조적으로, AP의 지속적인 활성을 오랫동안 지속 기판 회전율 및 높은 신호 대 잡음 비율을 허용한다. 따라서, 다른 색 기판과 AP 기자 효소를 사용하여 순차적 검출이 유효에서 성공 입증하고단일 배아 10-12,16 최대 세 가지 성적 증명서의 특징 검출.
이 멀티 타겟 발색 위시 (MC-WISH) 방법 (그림 1) (14)의 경우, 표시 안티센스 RNA 프로브는 시험 관내 전사에 의해 생성하고 사용할 수 합텐 – 라벨 중 하나를 표시했다. 배아는 포름 알데히드 및 메탄올 고정 처리 및 프로 테이나 제 K에 의해 투과성이 분해된다. 배아의 하이브리드 동시에 최대 세 다르게 표시 안티센스 RNA 프로브 다른 유전자에 대한 각각의 특정과 함께 실시한다. 엄격 세척하여 언 바운드 프로브를 제거한 후 각 합텐 – 레이블 검출 별도 라운드에서 시각화된다. 단일 검출 라운드 지역화 안정적인 색 침전물을 생성하는 AP-기판의 응용 프로그램에서 AP와 RNA를 시각화에 결합 된 항 합텐 항체와 배아의 배양으로 구성되어 있습니다. 항체의 검출 및 염색, 적용 항체-AP의 conju 후게이트는 낮은 pH 세척에 의해 제거된다. 다색 실험에서 검출 각 라운드는 다른 햅텐 레이블에 대해 표적 항체를 채용하고, 각 전사 패턴이 다른 색 기판 (표 1)에 의해 가시화된다. 배아는 글리세롤에 장착 및 미분 간섭 대비 (DIC)를 사용하여 광학 고해상도 화합물 현미경으로 이미지화된다.
방사능 표지 된 핵산 프로브를 원위치 혼성화 (ISH)에서 종종 조직 섹션에 RNA의 현지화를 검출하는데 사용된다. 방사성 ISH 방법은, 그러나, 덜 민감 시간 소모하며, 전체 마운트에서 전체 성적 분포 패턴의 감사를 허용하지 않습니다. 대조적으로, 본원에 기재된 MC-WISH 방법은 그대로 배아 내의 색 대조에서 여러 유전자의 발현 도메인의 직접적인 비교를 허용한다. MC-소원은 조직 학적 상황을 즉시 알 수있다 표준 시야 현미경으로 간단하게 시각화 장점이있다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현과 관련된 도메인을 신속하고 신뢰할 수있는 방법에 고유하고 중복 발현 부위를 정의하기 위해 제공한다. 한편, 멀티 플렉스 형광 ISH (FISH)는 감도 및 해상도에 대해 더 강력하며, 바람직하다면 셀룰러 또는 셀룰러 서브 재 사용되고mRNA의 검출의 용액이 필요하다.
MC-위시하여 매핑 된 성적 증명서의 넓은 스펙트럼은 거의 모든 증명서는 배아에서뿐만 아니라 애벌레 및 성인 조직과 초파리가 아닌 다른 종에서뿐만 아니라 분석 할 수 있음을 시사한다. 실제로, 초파리 여기 자세한 설명 절차는 제브라 피쉬 배아 11,16,22와 마찬가지로 효율적으로 작동합니다. 또, MC-WISH 방법은 무척추 동물과 척추 동물 배아 조직 표본의 다양한 적응 될 수있다.
합텐 – 라벨 및 프로브 농도
우리는 일상적으로 RNA 프로브의 합텐 레이블로 형광, 제닌, 및 비오틴을 사용합니다. 또한, 디 니트로 페놀 표지 된 프로브를 적용 할 수 있고, 제브라 피쉬 WISH 실험 23-25에 도입되어있다. 그 형광 가장 F를 사용하므로 형광 표지 된 프로브는 다른 햅텐 라벨에 비해 낮은 감도를 표시풍부한 성적 증명서 또는 검출. 각 새로 전사 프로브는 먼저 성능이 기판으로 BCIP / NBT 또는 고속 레드를 사용하거나 평가되는 단일 위시 실험에서 시험한다. 배경 개발없이 강한 신호가 몇 시간에 분 이내에 달성 될 때 프로브 농도를 최적으로 간주됩니다.
관심의 표현 영역이 MC-위시하여 자신의 전체 범위에서 발견되었는지 확인하기 위해, 가장 민감한 기판 조합, BCIP / NBT를 사용하여 단일 레이블 위시 실험에 의해 각각의 성적 패턴을 시각화하는 것이 필수적이다. 이것은 약한 발현 도메인이 멀티 타겟 실험에서 간과하지 않는 것을 보장한다. 다른 기판 조합의 적은 민감도를 보상하기 위해 그 표준 BCIP / NBT 염색에 비해 프로브 농도 (세배로) 배로 사용하는 것이 필수적이다.
낮은 pH 불 활성화
낮은 pH 불 활성화 단계로 이어질 수두 번째 및 세 번째 라운드에서 염색 감소 신호 검출 결과 안티센스 합텐 표지 된 RNA 프로브 / 센스 mRNA의 하이브리드의 부분 분해. 감도의 손실을 최소화하기 위해, 불 활성화 단계는 가능한 한 짧다. 우리는 낮은 pH에서 10 분 배양 시간은 AP-활동의 제거를위한 충분하다는 것을 경험했다. 많은 양의 후속 빠른 세척은 언 바운드 항체-AP 복합체의 신속한 희석을 보장하고 haptenized 프로브에 다시 결합을 방지 할 수 있습니다. 대체 절차는 파라 포름 알데히드 고정 및 열 불 활성화를 포함한다. 그러나, 컬러 석출물의 일부는 안정되지 않고, 가열 파라 포름 알데히드 고정은 AP의 완전한 불 활성화하기에 충분하지 않을 수있다. 첫 번째 적용 항체-AP 복합체의 불완전 불 활성화는 다음 검출 라운드 검출 할 두 번째 mRNA의 종 식 가양 중복으로 이어지는에서 mRNA의 패턴의 시각화를 다시 발생할 수 있습니다. 따라서, 대조 실험에서 번째전자 배아는 처음 적용된 항체-AP 복합체의 불 활성화 후 2 분획으로 분할됩니다. 제 항체-AP 복합체는 제어 부분에서 생략되고 제 2 색에 반응하는 신호를 생성 할 것이다. 제 2 색 반응이 처음에 대응하는 신호의 분포 패턴을 생성하는 경우 비활성화 절차는 비효율적이었다. 이 경우에, 낮은 pH 정지 용액에서 배양 시간은 다음 실험에 대해 연장한다.
AP 기판 애플리케이션의 오더
감도가 검출 이후의 각 라운드로 떨어 때문에, 이전에 더 풍부 성적에 덜 풍부한 mRNA를 검출하는 것이 좋습니다. 고속 염료가 바람직 강한 발현 사체 검출 용 제 염색 라운드에서 적용되도록 또한, 패스트 레드 및 블루 빠른 기판의 조합은 상당히 purpleblue의 BCIP / NBT 얼룩보다 덜 민감하다. 이 또한 시간후속 BCIP / NBT 염색 모니터링 및 purpleblue 신호 라이터 고속 염료 관련 너무 어두워지기 전에 시간에 정지 될 수있는 장점이있다. 따라서 표준 2 색 실험에서는 제 mRNA의 강한 발현은 패스트 레드에 의해 검출되고, 두 번째 약한 BCIP / NBT 의해. 그러나 잠시 후 확산 될 석출물을 생성 황색 INT 기판 조합이 적용될 수있다 고속 염료에 대한 대안으로서,. 따라서 BCIP / INT는 독점적으로 마지막 염색 라운드에서 적용된다. 따라서 세 가지 컬러 실험에서 우리는 종종 첫 번째 빠른 레드, 두 번째 BCIP / NBT (또는 고속 블루)와 세 번째 INT 기판의 조합을 사용합니다. 이 INT를 적용 할 때 가능한 한 빨리 스테인드 배아를 촬영하는 것이 좋습니다 있습니다.
아조 염료의 형광 검출
이는 어두운 색 침전물 라이터 하나 섀도우 때 중첩 발현 패턴을 인식하는 것이 때로는 어렵다. 에프또는 예를 들어, 강력한 개발 BCIP / NBT의 침전물 가벼운 빠른 염료 신호를 마스크 할 수 있습니다. 이 문제를 극복하는 한가지 방법은 각각의 염색 직후에 이미지를 캡쳐하고, 다음 검출 라운드 전에인가 색 침전물을 제거하는 것이다. 이 경우, 알코올 가용성 아조 염료 (패스트 레드) 및 INT 침전물을 각각 제 1 및 제 2 검출 발사 후 에탄올 세척에 의해 제거되고, BCIP / NBT 염색은 마지막 AP-기판 (26)으로인가된다. 또 다른 가능성은 아조 염료의 형광 특성을 활용할 수있다. 패스트 블루 원적외선 필터 (28, 29)에 의해 관찰 될 수있는 반면 패스트 레드 27 세트 로다 민 필터를 사용하여 가시화 될 수있다. 너무 조밀되고 아조 염료의 형광 신호를 급냉 않도록 비교 또는 발색 및 형광 화상의 중첩은, 시간에 정지되어야 공동 distribution.Using이 방법을, BCIP / NBT 신호 개발 사이트를 밝힐 수 반응 생성물.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |