Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.
Per analizzare reti di regolazione genica attivi durante lo sviluppo embrionale e organogenesi è essenziale definire con precisione come i diversi geni sono espressi in relazione spaziale tra loro in situ. Multi-bersaglio cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) facilita notevolmente il confronto istante di pattern di espressione genica, in quanto permette la visualizzazione distintivo di diverse specie di mRNA in colori contrastanti nello stesso campione di esempio. Ciò fornisce la possibilità di mettere in relazione i domini di espressione genica topograficamente reciprocamente con elevata precisione e definire siti espressione unica e sovrapposte. Nel protocollo presentato, si descrive una procedura MC-WISH per il confronto di modelli di espressione di mRNA di geni diversi in embrioni di Drosophila. Fino a tre sonde RNA, ciascuna specifica per un altro gene e etichettati da un aptene diverso, sono simultaneamente ibridato ai campioni embrione e successivamente rilevato da alcaline fosfatasi-based immunoistochimica colorimetrica. La procedura descritta è dettagliata qui per Drosophila, ma funziona altrettanto bene con embrioni di zebrafish.
In ibridazione in situ (ISH) è il metodo standard per il rilevamento e la localizzazione di trascritti di RNA in un contesto morfologico, in cellule, tessuti e organismi 1. I segnali prodotti dalla procedura ISH sono comunemente visualizzati mediante sistemi di rilevamento radioattive, fluorescenti e cromogeni. Negli ultimi anni significativi progressi tecnologici in ISH fluorescente (FISH) 2 provocato notevolmente migliorata sensibilità e risoluzione, consentendo l'individuazione e la quantificazione di espressione di RNA a singola cellula e livelli sub-cellulare e la visualizzazione di RNA fino a singole molecole 3,4 .Mentre sofisticati metodi FISH singola molecola sono utilizzati per applicazioni più specializzate, ISH cromogenica è diffusa come un RNA di routine で metodo di rilevazione in situ nella ricerca e nella diagnostica clinica. Per il rilevamento cromogenico sono utilizzati reazioni enzima di precipitazione, che generano prodotti visibili in colori contrastanti nei sitidell'ibridazione 5. Questo ha il vantaggio che la visualizzazione RNA può essere combinato con macchie istologiche di routine e contesto morfologico è immediatamente evidente al microscopio campo chiaro standard. Inoltre, numerosi dei substrati colore applicate producono precipitati, che sono stabili in mezzi organici di montaggio e / o acquosi, in modo che i preparati campioni permanenti possono essere ottenuti 5.
In Drosophila, protocolli iniziali ISH applicati sonde radioisotopi marcato per il rilevamento di trascrizione su materiale sezionato 6. Anche se è difficile ricostruire da sezioni di tessuto modelli trascrizione completa di interi embrioni o sistemi di organi, l'applicazione delle procedure ISH cromogeniche con sonde non marcati radioattivamente rende possibile rilevare globalmente distribuzioni RNA in Whole-monti 7. Sebbene esistano molte variazioni di ISH cromogenico, in tipico tutto il montaggio di ibridazione in situ (WISH) protocolli hybsonde aptenici marcata ridized vengono rilevati dagli anticorpi anti-aptenici coniugate ad un enzima giornalista e trascritti di mRNA sono visualizzabili da un cromogeno precipitante.
La tavolozza di precipitati di colore diverso prodotte dal reporter enzimi fosfatasi alcalina (AP), perossidasi (POD), e beta-galattosidasi (GAL) consente il rilevamento distintivo di bersagli multipli in uno stesso campione di 8-14. Tuttavia, POD attività enzimatica dura solo per un limitato periodo di tempo e la reazione colorimetrica GAL è meno sensibile, in modo che senza ulteriore segnale (tiramide) amplificazione 15 il rilevamento di trascritti meno abbondanti può essere difficile con questi enzimi. Al contrario, l'attività duraturo di AP permette fatturato duraturo substrato ed alto rapporto segnale-rumore. Pertanto, l'individuazione sequenziale utilizzando AP giornalista enzima con i substrati di colore diverso si è dimostrata efficace nella efficace erilevamento distintivo di un massimo di tre differenti trascritti in singoli embrioni 10-12,16.
Per questo multi-target WISH cromogenico (MC-WISH) Metodo (Figura 1) 14, sonde di RNA antisenso marcate sono generate mediante trascrizione in vitro e contrassegnate con uno dei aptenici etichette disponibili. Gli embrioni sono formaldeide fisso e permeabilizzate mediante trattamento metanolo e proteinasi K digestione. Ibridazione degli embrioni avviene contemporaneamente con un massimo di tre sonde di RNA antisenso in modo diverso ogni etichetta specifiche per un gene diverso. Dopo la rimozione della sonda non legata da lavaggi stringenza ogni aptene-label è visualizzata in un giro di rilevazione separata. Un singolo round rilevamento consiste di incubazione di embrioni con un anticorpo anti-aptene accoppiato ad AP e visualizzazione RNA mediante l'applicazione di un AP-substrato che produce un precipitato di colore stabile localizzata. Dopo il rilevamento degli anticorpi e la colorazione, il applicata conju anticorpo-APcancello viene rimosso mediante lavaggio basso pH. In esperimenti multicolore, ogni turno di rilevamento impiega un anticorpo diretto contro un aptene-label differenti e ciascuno schema trascritto è visualizzata da un substrato diverso colore (Tabella 1). Gli embrioni sono montati in glicerolo e ripreso sotto un microscopio composto ad alta risoluzione usando contrasto di interferenza differenziale (DIC) ottica.
In ibridazione in situ (ISH) con sonde di acidi nucleici marcati radioattivamente viene spesso utilizzato per rilevare la localizzazione di RNA su sezioni di tessuto. Il metodo ISH radioattivo, tuttavia, è che richiede tempo, meno sensibile, e non consente apprezzamento complete distribuzioni trascrizione di interi-monti. Al contrario, il metodo MC-WISH qui descritta permette il confronto diretto di più domini di espressione genica in colori contrastanti all'interno embrioni intatti. MC-WISH ha il vantaggio che contesto istologico è immediatamente evidente e visualizzata semplicemente microscopio campo chiaro standard. Ciò fornisce la possibilità di mettere in relazione i domini di espressione genica topograficamente reciprocamente con elevata precisione e definire siti espressione unica e sovrapposte in modo veloce ed affidabile. D'altra parte, ISH fluorescente multiplato (FISH) è più potente rispetto alla sensibilità e risoluzione ed è preferibilmente utilizzato, se cellulare o addirittura ri subcellulareè necessaria una soluzione di rilevamento mRNA.
L'ampio spettro di trascrizioni che è stato mappato da MC-WISH suggerisce che praticamente qualsiasi trascrizione può essere analizzato non solo in embrione, ma anche nei tessuti larvali e adulti e in specie diverse da Drosophila. Infatti, la procedura descritta dettagliatamente qui per Drosophila, funziona in modo simile efficiente con embrioni di zebrafish 11,16,22. Inoltre, il metodo MC-WISH può essere adattato ad una grande varietà di invertebrati e vertebrati embrioni e campioni di tessuto.
Hapten-etichette e le concentrazioni di sonda
Usiamo abitualmente fluoresceina, digossigenina, e biotina come etichette aptenici di sonde di RNA. Inoltre, dinitrofenolo sonde marcate possono essere applicate, che sono stati introdotti in esperimenti WISH zebrafish 23-25. Sonde marcato con fluoresceina mostrano una sensibilità minore rispetto alle altre aptenici etichette, in modo che fluoresceina è meglio utilizzato fo il rilevamento dei trascritti abbondanti. Ogni sonda appena trascritto viene prima testato in un esperimento WISH singolo, dove la sua performance è valutata sia utilizzando BCIP / NBT o Fast Red come substrato. Una concentrazione sonda viene considerato ottimale quando un segnale forte senza sviluppo di fondo viene raggiunto entro pochi minuti per ora.
Per assicurarsi che i domini di espressione di interesse sono stati individuati in tutta la loro estensione da MC-WISH, è essenziale per visualizzare ogni modello trascritto da monomarca esperimenti WISH utilizzando la combinazione substrato più sensibile, BCIP / NBT. Questo assicura che i domini di espressione deboli non sono trascurati nell'esperimento multi-target. Per compensare la minore sensibilità delle altre combinazioni substrato è essenziale utilizzare raddoppiato (da triplicato) concentrazioni sonda rispetto allo standard BCIP / NBT colorazione.
Basso inattivazione pH
L'inattivazione passo pH basso può portare ala disintegrazione parziale delle antisenso aptenici marcata ibridi RNA sonda / senso di mRNA con conseguente rilevazione del segnale ridotta nel secondo e terzo round di colorazione. Per minimizzare la perdita di sensibilità, le fasi di inattivazione sono il più breve possibile. Abbiamo sperimentato che un tempo di incubazione 10 min a pH basso è sufficiente per l'eliminazione di AP-attività. I successivi lavaggi rapidi in grandi volumi garantiscono rapida diluizione di non legati coniugati anticorpo-AP e prevenire ri vincolante alle sonde haptenized. Procedure alternative includono paraformaldeide fissazione e l'inattivazione di calore. Tuttavia, alcuni dei precipitati a colori non sono stabili al calore e fissazione paraformaldeide potrebbe non essere sufficiente per una completa inattivazione di AP. Inattivazione incompleta della prima applicata anticorpo coniugato AP può portare a ri-visualizzazione del pattern mRNA nel seguente rilevamento turno portando a falsi positivi sovrapposizione nell'espressione con la seconda specie di mRNA da rilevare. Pertanto, in un esperimento di controllo the gli embrioni sono divisi in due frazioni dopo inattivazione della prima applicato anticorpo-AP coniugato. Il secondo anticorpo coniugato con AP viene omesso dalla frazione di controllo e non deve generare un segnale nella seconda reazione cromatica. Tuttavia, se la seconda reazione cromatica genera un modello di distribuzione segnale corrispondente alla prima, poi la procedura di inattivazione non era efficiente. In questo caso, il tempo di incubazione in soluzione di stop basso pH dovrebbe essere prolungato per il prossimo esperimento.
Ordini di applicazione substrato AP
Poiché la sensibilità gocce ogni successivo ciclo di rilevamento, è opportuno rilevare mRNA meno abbondanti prima trascritti più abbondanti. Inoltre, il Fast Red e veloci combinazioni substrato blu sono molto meno sensibili rispetto al purpleblue BCIP / NBT macchia, in modo che i coloranti veloci sono preferibilmente applicati al primo turno colorazione per il rilevamento del più forte trascrizione espresso. Anche questo hcome il vantaggio che la successiva BCIP / NBT colorazione può essere monitorato e fermato in tempo prima che il segnale diventa troppo purpleblue scura in relazione alle leggeri coloranti veloci. Così in un esperimento due colori standard, prima forte espresso mRNA viene rilevato da Fast Red e secondo il più debole da BCIP / NBT. Come alternativa ai coloranti veloci combinazioni substrato INT giallo possono essere applicate, che però produrre precipitati che diventare diffuso dopo qualche tempo. Pertanto BCIP / INT si applica esclusivamente nel turno precedente colorazione. Di conseguenza, in un esperimento a tre colori spesso usiamo primo Fast Red, secondo BCIP / NBT (o Fast Blue) e il terzo una combinazione substrato INT. Si noti che è consigliabile fotografare embrioni macchiate appena possibile quando si applica INT.
Rilevazione fluorescente di coloranti azoici
Può essere a volte difficile riconoscere pattern di espressione di sovrapposizione quando un precipitato colore più scuro è shadowing uno leggero. Fo l'esempio, un fortemente sviluppato precipitato BCIP / NBT può mascherare i segnali di tintura veloce più leggeri. Un modo per aggirare questo problema è quello di catturare le immagini subito dopo ogni colorazione e rimuovere il precipitato colore applicato prima del prossimo turno di rilevamento. In questo caso, alcool-solubile azo colorante (Fast Red) e INT precipitati vengono rimossi da lavaggi etanolo dopo la prima e la seconda rilevazione, rispettivamente, e BCIP / NBT colorazione viene applicata come ultimo AP-substrato 26. Un'altra possibilità è quella di sfruttare le proprietà fluorescenti di coloranti azoici. Fast Red può essere visualizzato utilizzando il filtro rodamina imposta 27, mentre Fast Blue può essere osservato con i filtri lontano-rosso 28,29. Confronto o sovrapposizione di immagini cromogenici e fluorescenti possono rivelare il luogo di sviluppo segnale BCIP / NBT co-distribution.Using questo approccio deve essere fermato in tempo, in modo che non diventi troppo denso e spegnere il segnale fluorescente del colorante azoico prodotto di reazione.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |