Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.
Pour analyser les réseaux de régulation des gènes actifs pendant le développement embryonnaire et l'organogenèse il est indispensable de définir avec précision la façon dont les différents gènes sont exprimés dans une relation spatiale les uns aux autres in situ. Multi-cible chromogène ensemble de montage hybridation in situ (MC-WISH) facilite grandement la comparaison instantanée de profils d'expression des gènes, car il permet la visualisation distinctif des différentes espèces d'ARNm dans des couleurs contrastantes dans le même échantillon de l'échantillon en. Ceci permet d'obtenir la possibilité de relier des domaines d'expression de gène topographiquement les uns aux autres avec une grande précision et pour définir des sites uniques qui se chevauchent et expression. Dans le protocole présenté, nous décrivons une procédure MC-WISH pour comparer les profils d'expression d'ARNm de gènes différents dans les embryons de drosophile. Jusqu'à trois sondes d'ARN, chacun spécifique d'un autre gène et marqué par un haptène différents, sont simultanément hybridée à des échantillons d'embryons et ensuite détecté par un alcaline phosphatase basée immunohistochimie colorimétrique. La procédure décrite est détaillé ici pour la drosophile, mais fonctionne aussi bien avec des embryons de poisson zèbre de.
L'hybridation in situ (ISH) est la méthode standard pour la détection et la localisation des transcrits d'ARN dans un contexte morphologique, à l'intérieur de cellules, de tissus et d'organismes 1. Les signaux produits par la procédure de ISH sont habituellement visualisés par des systèmes de détection radioactifs, fluorescents et chromogènes. Au cours des dernières années, des progrès technologiques importants dans ISH fluorescente (FISH) 2 ont entraîné considérablement amélioré la sensibilité et la résolution, permettant la détection et la quantification d'expression de l'ARN à cellule unique et les niveaux sub-cellulaires et de l'ARN visualisation jusqu'à molécules simples 3,4 .While méthodes FISH seule molécule sophistiqués sont utilisés pour des applications plus spécialisées, ISH chromogène est très répandue comme un ARN de routine dans la méthode de détection in situ dans la recherche et le diagnostic clinique. Pour la détection chromogène réactions de précipitation de l'enzyme sont utilisés, qui génèrent des produits visibles dans des couleurs contrastantes sur les sitesde 5 l'hybridation. Ceci présente l'avantage que l'ARN visualisation peut être combinée avec la routine coloration histologique et morphologique contexte est immédiatement évident par microscopie en fond clair standard. En outre, de nombreux des substrats de couleurs appliquées produisent des précipités, qui sont stables dans des milieux de montage organiques et / ou aqueux, de sorte que les préparations d'échantillonnage permanentes peuvent être obtenus 5.
Chez la drosophile, les protocoles de ISH initiale appliquée sondes de radio-isotopes marqué pour la détection de la transcription sur le matériel en coupe 6. Bien qu'il soit difficile de reconstruire à partir de coupes de tissus modèles complets de transcription d'embryons entiers ou des systèmes d'organes, l'application des procédures de ISH chromogènes avec des sondes non marquées de manière radioactive permet d'globalement détecter les distributions d'ARN dans entières montures 7. Bien qu'il existe de nombreuses variantes de ISH chromogène, dans le typique entier monter hybridation in situ (WISH) dans les protocoles hybdes sondes d'haptène marqué ridized sont détectées par des anticorps anti-haptène conjugué à une enzyme rapporteur et transcrits d'ARNm sont visualisées par un chromogène de précipitation.
La palette de couleurs différentes de précipités produits par le reporter enzymes phosphatase alcaline (AP), la peroxydase de raifort (POD), et la bêta-galactosidase (GAL) permet la détection de cibles multiples distinctif dans un seul et même échantillon 14.8. Cependant, POD activité enzymatique ne dure que pendant une période de temps limitée et la réaction colorimétrique GAL est un peu moins sensible, de sorte que sans supplémentaire signal (tyramide) amplification 15 la détection de transcrits moins abondantes peut être difficile avec ces enzymes. En revanche, l'activité durable de AP permet de chiffre d'affaires de substrat de longue durée et rapport signal-sur-bruit. Par conséquent, la détection séquentielle utilisant AP enzyme rapporteur avec des substrats de différentes couleurs a fait ses preuves dans l'efficace etdétection distinctif de jusqu'à trois transcriptions différentes dans les embryons simples 10-12,16.
Pour ce souhait chromogène multi-cible (MC-WISH) méthode (Figure 1) 14, des sondes d'ARN antisens marquées sont générées par transcription in vitro et marqués avec un des haptène-étiquettes disponibles. Les embryons sont formaldéhyde fixées et perméabilisées par traitement à la protéinase K et du methanol digestion. L'hybridation des embryons est effectuée simultanément avec jusqu'à trois sondes ARN antisens marquées différemment chaque spécifiques d'un gène différent. Après le retrait de la sonde non liée par des lavages de stringence chaque haptène-label est visualisée dans un tour séparé de détection. Un seul tour de détection se compose d'incubation d'embryons avec un anticorps anti-haptène couplé à AP et de l'ARN visualisation par application d'un AP-substrat qui produit un précipité de couleur stable localisée. Après la détection d'anticorps et la coloration, l'Conju anticorps AP appliquéeporte est éliminé par un lavage à faible pH. Dans des expériences multicolores, chaque cycle de détection emploie un anticorps dirigé contre un haptène-marqueur différent et chaque motif de transcription est révélée par un substrat de couleur différente (tableau 1). Les embryons sont montées dans du glycerol et imagés sous un microscope composé à haute résolution en utilisant contraste interférentiel différentiel (DIC) optique.
L'hybridation in situ (ISH) avec des sondes d'acides nucléiques marquées de manière radioactive est souvent utilisé pour détecter la localisation d'ARN sur des coupes de tissus. La méthode de ISH radioactifs, cependant, est consommatrice de temps, moins sensible, et ne permet pas l'appréciation des motifs complets de distribution de transcription en entier montures. En revanche, la méthode MC-WISH décrit ici permet la comparaison directe de plusieurs domaines d'expression de gènes dans des couleurs contrastantes dans les embryons intacts. MC-CŒUR présente l'avantage de contexte est immédiatement évident histologique et visualisée simplement par microscopie sur fond clair standard. Cela donne la possibilité de relier les domaines d'expression génique topographiquement à l'autre avec une grande précision et définir les sites d'expression uniques et se chevauchent d'une manière rapide et fiable. D'autre part, ISH fluorescente multiplexé (FISH) est plus puissant par rapport à la sensibilité et la résolution et est utilisé de préférence, si cellulaire ou même re sub-cellulairesolution de détection de l'ARNm est nécessaire.
Le large éventail de produits de transcription qui a été cartographiée par MC-WISH suggère que pratiquement toute transcription peut être analysé non seulement dans l'embryon, mais aussi dans les tissus larvaires et adultes et d'autres espèces que la drosophile. En effet, la procédure décrite en détail ici pour la drosophile, fonctionne de façon similaire efficace avec des embryons de poisson zèbre de 11,16,22. En outre, la méthode MC-WISH peut être adapté à une grande variété d'invertébrés et de vertébrés embryons et spécimen de tissu.
Haptène étiquettes et les concentrations de sonde
On utilise couramment la fluorescéine, la digoxigénine et la biotine comme haptène étiquettes de sondes d'ARN. En outre, des sondes de dinitrophénol marqué peuvent être appliquées, qui ont été introduites dans les expériences 23-25 WISH poisson zèbre. Les sondes marquées à la fluorescéine présentent une sensibilité moindre par rapport aux autres haptène-étiquettes, de sorte que la fluorescéine est mieux utilisé fou la détection des transcrits abondants. Chaque sonde nouvellement transcrit est d'abord testée dans une expérience de seul souhait, où sa performance est évaluée soit en utilisant BCIP / NBT ou Fast Red comme substrat. Une concentration de la sonde est considérée comme optimale lorsque un signal fort sans développement de fond est atteint en quelques minutes à une heure.
Pour vous assurer que les domaines d'expression d'intérêt ont été détectés dans toute leur étendue par MC-WISH, il est essentiel pour visualiser chaque profil de transcription par une seule étiquette expériences WISH utilisant la combinaison du substrat le plus sensible, BCIP / NBT. Cela garantit que la faiblesse des domaines d'expression ne soient pas négligés dans l'expérience multi-cible. Pour compenser la moindre sensibilité des autres combinaisons de substrat, il est essentiel d'utiliser doublé (à triplé) des concentrations de sonde par rapport à BCIP / NBT coloration standard.
PH faible inactivation
L'étape d'inactivation de pH faible peut conduire àdésintégration partielle des ARN antisens sonde hybrides / ARNm sens haptène marqué résultant de la détection du signal réduit dans les deuxième et troisième cycles de coloration. Pour minimiser la perte de la sensibilité, les étapes d'inactivation sont aussi courts que possible. Nous avons vécu que le temps d'incubation de 10 min à pH faible est suffisante pour l'élimination de l'AP-activité. Les lavages rapides ultérieures dans de grands volumes d'assurer une dilution rapide des non liées conjugués anticorps-AP et empêcher la ré-lier aux sondes hapténisée. D'autres procédures sont la fixation de paraformaldéhyde et l'inactivation de chaleur. Cependant, certains des précipités de couleur ne sont pas stables à la chaleur et le paraformaldéhyde fixation peut ne pas être suffisant pour l'inactivation complète des AP. Inactivation incomplète de la première appliquée conjugué anticorps-AP peut conduire à re-visualisation de la structure de l'ARNm dans la détection suivante leader ronde pour chevauchement faux positif dans l'expression avec la deuxième espèce d'ARNm à détecter. Par conséquent, dans une expérience témoin èmee embryons sont divisées en deux fractions, après l'inactivation de la première appliquée conjugué anticorps-AP. Le deuxième conjugué anticorps-AP est omis de la fraction de contrôle et ne doit pas produire un signal dans la seconde réaction colorée. Cependant, si la réaction de deuxième couleur génère un motif de distribution de signaux correspondant à la première, puis la procédure d'inactivation n'a pas été efficace. Dans ce cas, le temps d'incubation dans une solution d'arrêt à faible pH doit être prolongée pour l'expérience suivante.
Les commandes d'application de substrat AP
Etant donné que la sensibilité diminue avec chaque cycle de détection ultérieur, il est préférable de détecter les ARNm moins abondantes avant transcrits plus abondantes. En outre, le Fast Blue combinaisons de substrat Fast Red et sont nettement moins sensible que l'purpleblue BCIP / NBT tache, de sorte que les colorants rapides sont appliquées de préférence dans le premier tour de coloration pour la détection de la transcription exprimé plus fort. Cela a également hcomme l'avantage ultérieur BCIP / NBT coloration peut être surveillé dans le temps et est arrêté avant que le signal d'obscurité devient trop purpleblue en ce qui concerne les colorants rapides légers. Ainsi, dans une expérience de deux-couleur standard, d'abord l'ARNm exprimé plus forte est détectée par Fast-Rouge et du deuxième le plus faible par BCIP / NBT. Comme une alternative aux colorants rapides les jaunes combinaisons de substrat INT peuvent être appliquées, qui produisent cependant précipités qui deviennent floues après un certain temps. Par conséquent BCIP / INT est exclusivement appliquée dans le dernier tour de coloration. Par conséquent, dans une expérience de trois couleurs, nous utilisons souvent le premier Fast Red, deuxième BCIP / NBT (ou Fast Blue) et le troisième une combinaison de substrat INT. Notez qu'il est conseillé de photographier embryons colorés dès que possible lors de l'application INT.
Détection fluorescente de colorants azoïques
Il peut être parfois difficile de reconnaître des modèles d'expression qui se chevauchent quand un précipité de couleur plus foncée est un ombrage un briquet. Fou par exemple, un précipité BCIP / NBT fortement développé peut masquer les signaux de colorants rapides légers. Une façon de contourner ce problème consiste à capturer des images immédiatement après chaque coloration et éliminer le précipité de couleur appliquée avant la prochaine ronde de détection. Dans ce cas, colorant azoïque soluble dans l'alcool (Fast Red) et INT précipités sont éliminés par lavages d'éthanol après les premier et deuxième tours de détection, respectivement, et BCIP / NBT coloration est appliqué comme le dernier substrat AP-26. Une autre possibilité est de profiter des propriétés de fluorescence de colorants azoïques. Fast Red peut être visualisée à l'aide filtre rhodamine fixe 27, tandis que le Blue rapide peut être observée avec des filtres rouge lointain 28,29. Comparaison ou superposition d'images chromogènes et fluorescentes peuvent révéler le site de co-distribution.Using cette approche, le développement de signal BCIP / NBT doit être arrêté dans le temps, de sorte qu'il ne devienne pas trop dense et étancher le signal fluorescent du colorant azoïque produit de réaction.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |