Multi-target Chromogene Whole-mount<em> In Situ</em> Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em> Drosophila</em> Embryo

1. Labeling van RNA-probes in vitro door transcriptie Monteer in vitro transcriptie reactie in 1,5 ml microbuisjes onder RNase-vrije omstandigheden: 10,5 pi DEPC behandeld H2O, 4,0 pi 5x transcriptiebuffer, 1,0 pl (1 pg) gelineariseerd gezuiverde template DNA in DEPC behandeld H 2 O, 1,3 ui NTP mix, 0,7 gl-hapteen gelabeld UTP, 0,5 pi RiboLock RNA inhibitor, 2,0 ul RNA-polymerase. Opmerking: Het uiteindelijke reactievolume 20 pl. Afhankelijk van de sjabloon promotorsequentie gebruik T7, T3 of SP6 RNA polymerase voor de in vitro transcriptie (zie referentie 17). Selecteer digoxigenine-11-UTP, biotine-16-UTP of fluoresceïne-12-UTP als label voor de RNA-probe. Voor meer informatie, zie de bespreking van hapteen-labels en probe concentraties in de discussie. Meng transcriptiereactie en spin down binnenkort. Laat transcriberengedurende 3 uur bij 37 ° C. Voeg 1 ul RNase-vrij DNase I bij de transcriptie reactie voor verwijdering van matrijs DNA, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Pas met DEPC behandeld H 2 O van het monster volume tot 200 ul. Voeg 100 pl (0,5 vol) 7,5 M ammoniumacetaat en 600 pl (3 vol) ethanol gelabelde RNA-probe precipiteren. Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Gebruik ijskoude ethanol, omdat dit kan leiden tot ongewenste precipitatie van opgenomen nucleotiden. Spin down het getranscribeerde RNA in een temperatuurgeregelde centrifuge bij maximale snelheid (20.800 x g) gedurende 30 min bij 20 ° C. Zorgvuldig aspireren supernatans. Was de resulterende pellet met 70% ethanol bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Verwijder supernatant en wees voorzichtig niet om de losse pellet ongeluk te zuigen. Laat pellet drogen in microbuisjes met geopende deksel voor een paar minuten bij kamertemperatuur. Disoplossen van de verkregen pellet in 100 pl DEPC behandeld H 2 O. Voeg 300 pi pre-hybridisatiebuffer (50% vol / vol gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 50 ug / ml heparine natriumzout, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml morulagist RNA) en bewaar bij -20 ° C . Probes kunnen langdurige bewaard bij -20 ° C. Opmerking: Voor een eerste test van de nieuw getranscribeerd probe verdunde 3 ul-hapteen gelabelde RNA probe in 100 ul hybridisatie buffer om de uiteindelijke concentratie van de WISH experiment te verkrijgen. 2. Verwerking van Embryo monsters met behulp van Voegt Opmerking: Het gebruik microbuisjes of multi-well platen voor verwerking embryo door de verschillende incubatiestappen draagt ​​het risico dat significante hoeveelheden embryo's er per ongeluk opzuigen tijdens uitwisseling van oplossingen. Om dit verlies te voorkomen, kan het nuttig zijn om manden (zoals netwell inserts) voor het vervoer van embryo monsters door de procedure te gebruiken. Deze zijn polystyreeninserts met een polyester maas op de bodem (Figuur 2A), waarvan de embryo rusten tijdens de verwerking. Voor de verwerking van embryo's in de WISH procedure, de montage van de inserts in een 12-well plaat (Figuur 2B) en voeg 2 ml van de juiste oplossing in elk putje. Pipetteer de embryo's in de inserts met behulp van een blauwe tip. Zorg ervoor dat alle embryo's worden ondergedompeld in een vloeistof. Wanneer incubatietijd voorbij de plaats embryo-bevattende inserts in een 12-well plaat, die is gevuld met de oplossing voor de volgende stap. Gebruik dragers en handvatten (figuur 2C) te dragen tot 12 monsters tegelijkertijd van de ene naar de andere oplossing (figuur 2D). Opmerking: Om de vereiste volumes te verminderen, gebruik 2,0 ml microbuisjes voor de pre-hybridisatie / hybridisatie stappen (zie stap 4.1) en de 24-well platen voor de kleuring reacties (STEP 6.2). De hybridisatie en kleuring reacties worden uitgevoerd in volumina van 1001, l en 400 gl resp. 3. Bereiding van embryo's voor hybridisatie Verzamelen, dechorionate, repareren en devitellinize embryo's met behulp van standaard procedures 14,18. De bereide embryo routinematig bewaard in methanol bij -20 ° C. Transfer embryo's worden gebruikt voor in situ hybridisatie tot kamertemperatuur en gedistribueerd naar de inserts van een 12-wells plaat gevuld met 2 ml methanol per putje. Hydrateren embryo's door een afnemende reeks methanol bij kamertemperatuur. Incubeer embryo telkens 3 minuten in: (i) 75% methanol in 1x PBS (ii) 50% methanol in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% methanol in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% Tween-20. Pre-fix het embryo in 4% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Verwijder het fixeermiddel door 4 wassingen gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Ondertussen ontdooien en bereiden proteinase K en glycine werkende oplossingen. <li> Permeabilize embryo in vers proteinase K (10 ug / ml tot 50 ug / ml) in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 gedurende 3 min bij RT. Opmerking: De proteinase K behandeling uitgebalanceerd om de sterkte van embryo fixatie. Bijvoorbeeld, als de pre-fixatiestap (3,4) wordt weggelaten, zachtere proteinase K behandeling worden toegepast. Stop de reactie door twee spoelingen in 1 min 2 mg / ml glycine in 1x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Na de vaststellen van de embryo's in 4% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Vervolgens verwijdert paraformaldehyde fixeermiddel door wassen viermaal gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Transfer achteraf vast embryo's voor een pre-hybridisatiebuffer. WINKEL embryo pre-hybridisatie buffer bij -20 ° C of direct tot hybridisatie van probes. 4. Hybridisatie probes Transfer embryo bewaard bij -20 ° C in pre-hybridisatiebuffer tot kamertemperatuur. Verdeel embryo in de pre-hybridisatie buffer in 2,0 ml microtubes. Gedurende 30 min op een minimum, pre-embryo hybridiseren monsters bij 65 ° C in pre-hybridisatiebuffer. Opmerking: Voor pre-hybridisatie en hybridisatie stappen een waterbad wordt gebruikt. Tijdens pre-hybridisatie er tijd om de probe-mengsel te bereiden uit maximaal drie antisense RNA probes, elk specifiek voor een ander gen transcript en gelabeld met een ander hapteen. Om de probe-mengsel te verkrijgen, voeg samen geschikte hoeveelheden (gewoonlijk tussen 1 pi tot 6 pl) van elk gewenst oorspronkelijke hapteen gemerkte antisense RNA-probe van 100 ul hybridisatiebuffer (50% vol / vol gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 50 ug / ml heparine natriumzout, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml torula RNA, 5% w / v dextran sulfaat). Opmerking: Het toevoegen van dextransulfaat is optioneel. Denatureren de antisense RNA-probe-mengsel in een verwarmingsblok bij 80 ° C gedurende 5 min. Vervolgens overdracht van de gedenatureerde probe-mengsel direct op 65 ° C. Verwijder het meeste pre-hybridisatiebuffer uit het embryo samples op de gedenatureerde probe-mengsel. Laat embryo monsters hybridiseren met probe mix O / N bij 65 ° C. Opmerking: temperaturen tussen 55 ° C en 65 ° C worden routinematig gebruikt voor hybridisatie, pre- en post-hybridisatie stappen. Hybridisatie bij 65 ° C biedt strengste voorwaarden wordt aanbevolen bij achtergrondproblemen bij gebruik van lagere temperaturen. Als er geen achtergrondproblemen, hybridisatie bij 55 ° C aanbevolen, die het voordeel van verbeterde signaalsterkte en verbeterde embryo integriteit verschaft. De volgende morgen eerst de stringentie wasoplossingen overbrengen naar 65 ° C, om ervoor te zorgen dat ze verwarmd tot de juiste temperatuur in de tijd. Transfer hybridisatieprobe mix met embryo's uit 2,0 ml microbuisjes inserts in een 12-wells plaat met 2 ml voorverwarmd hybridisatie wasbuffer (50% formamide in 2 x SSC, 0,1% Tween-20). Plaats de 12-wells plaat met het emBryo monsters in een oven en incubeer gedurende 20 minuten bij 65 ° C. Transfer embryo monsters 2 ml nieuwe hybridisatie wasbuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 65 ° C. Herhaal nog een keer deze stap. Verwijder overmaat probe door 20 minuten wassen bij 65 ° C, eenmaal in 2 x SSC, 0,1% Tween-20 en drie maal in 0,2 x SSC, 0,1% Tween-20. Breng de embryo monsters 1x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Incubeer de embryo's in blokkerende buffer (8% schapen serum in 1x PBS, 0,1% Tween-20) gedurende ten minste 30 min bij kamertemperatuur. 5. Antibody Detectie van hapteen-gelabelde probes Opmerking: In tegenstelling tot de gelijktijdige hybridisatie van drie verschillend gemerkte probes, wordt elke probe gedetecteerd na elkaar in afzonderlijke ronden van antilichaam incubatie en kleuring. Daarom is in elk detectie door slechts één antilichaam wordt gebruikt (ofwel anti-digoxigenine-AP of anti-fluoresceïne-AP of anti-biotine-AP). Kies tussen STEP5.1.1 tot 5.1.3 en vult het bereiden van de geschikte antilichaam verdunning volgens de hapteen-label dat moet worden gedetecteerd. Opmerking: Voor opeenvolgende detectie van de verschillend gemerkte probes, wordt een anti-hapteen antilichaam toegepast in elke detectiecyclus. Voor detectie van een fluoresceïne-gelabelde probe verdund anti-fluoresceïne AP-conjugaten 1: 4000 in blokkerende buffer. Voor detectie van een digoxigenine-gemerkte probe verdund anti-digoxigenine-AP conjugaten 1: 4000 in blokkerende buffer. Voor detectie van een met biotine gelabelde probe bereiden van een anti-biotine-AP conjugaat oplossing bij een 1: 4000 verdunning in blokkeerbuffer. Incubeer embryo's in de geselecteerde anti-hapteen-AP oplossing gedurende 3 tot 4 uur bij KT. Als alternatief, incubeer O / N bij 4 ° C. Niet alle drie antilichamen niet gelijktijdig van toepassing. Om ongebonden antilichaam te verwijderen was de embryo met 1x PBS, 0,1% Tween-20 gedurende 4 maal 15 minuten bij kamertemperatuur. Om buffersystemen veranderen wash tweemaal 15 min bij kamertemperatuur in TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Tween-20). 6. alkalische fosfatase Chromogene kleuring Na antilichaamdetectie kiezen STEP 6.1.1 tot 6.1.4 en vervolgens één van de alkalische fosfatase kleuring chromogene reactie op het gewenste kleursignaal te verkrijgen (zie tabel 1). Voor elke ronde van de detectie een andere chromogene substraat reactie wordt toegepast op elke transcript patroon in een andere kleur te markeren. Fast Red kleuring Was de embryo tweemaal gedurende 15 min in TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% Tween-20). Terwijl het wassen van embryo's, de voorbereiding van de Fast Rode vlekken oplossing uit de Fast Red TR / NAMP alkalisch fosfatase Substrate Tabletten Set. Ontbinding van een buffer tablet uit de set in 1 ml gedestilleerd water tablet en meng door vortexen tot 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 te verkrijgen. Drop een Fast Red TR / NAMP tablet in de voorbereide Tris buffer en los door vortexen om de Fast Red kleuring oplossing te verkrijgen. Clear Fast Red kleuroplossing van niet-opgeloste deeltjes door een 0,2 urn spuitfilter. Fast Blue kleuring Was embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB8.2 kleurbuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20). Tijdens het wassen embryo, bereid de Fast Blue kleuring oplossing van 50 mg / ml Fast Blue BB (in DMF) en 50 mg / ml naftol fosfaat (in DMSO) voorraadoplossingen. Vers bereid een Fast Blue BB oplossing bij 0,5 mg / ml in SB8.2. Vers bereid een aparte naftol fosfaatoplossing bij 0,5 mg / ml in SB8.2. Druppelsgewijs de bereide naftol fosfaatoplossing in de Fast Blue BB oplossing onder constant mengen met een vortex toe. De resulterende uiteindelijke werking concentratie 0,25 mg / ml voor zowel substraatbestanddelen. Opmerking: Verschillende Snel Blauw / nafthol Phosphaat combinaties resulteren in verschillende tinten (zie tabel 1). BCIP / NBT kleuring Was embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB9.5 kleurbuffer (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, 0,1% Tween-20). Voor een purpleblue chromogene signaal, vers BCIP / NBT kleuroplossing te bereiden door het toevoegen van 1 pi levamisol, 3,5 gl BCIP en NBT 4,5 gl per ml SB9.5 vlekken buffer en meng. INT kleuring Was de embryo tweemaal gedurende 15 min in vers SB9.5 kleurbuffer. Voor een geelbruin chromogene signaal, vers INT kleuroplossing te bereiden door het toevoegen van 1 pi levamisol, 5 pl Magenta-Phos en 5 gl INT per ml SB9.5 vlekken buffer en meng. Let op: U kunt ook gebruik maken van 7,5 pl / ml BCIP / INT kant-en-klare kleuroplossing. Voor de kleuring reactie overdracht embryo monsterseen 24-wells plaat. Incubeer elk monster in 400 ul van de gekozen kleuroplossing in het donker. Monitor signaal af en ontwikkeling onder een stereomicroscoop. Stop de kleuring reactie wanneer de gewenste signaalsterkte wordt verkregen en voor belangrijke achtergrond signaal wordt waargenomen. Om de chromogene reactie te stoppen overbrengen lood inserts van embryo's in een 12-wells plaat met 2 ml TNT per putje. Spoel de gebrandschilderde embryo's twee maal in TNT. Was de embryo tweemaal gedurende 10 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur om resterende substraat te verwijderen. 7. Antibody Verwijdering / alkalisch fosfatase Inactivatie Verwijder antilichaam en inactiveren alkalisch fosfatase door incubatie in 2 ml lage pH stopoplossing (0,1 M glycine-HCl pH 2,2, 0,1% Tween-20) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. 1 min spoelen met 2 ml van 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. Was 3 maal gedurende 3 min in 1 x PBS, 0,1% Tween-20 bij kamertemperatuur. 8. Tweede Detection Ronde Aan de distributie patroon van een tweede transcript te sporen verder te gaan met de detectie van antilichaam-hapteen gelabelde probes (STEP 5,1-5,4) met behulp van antilichaam-AP conjugaten gericht tegen het tweede hapteen-label. Voer alkalische fosfatase chromogene kleuring (stap 6,1 tot 6,5) het aanbrengen van een substraat combinatie die een contrasterende kleur aan die gebruikt in de eerste detectie round produceert (beschikbare kleuren zie Tabel 1). Verwijder tweede antilichaam-AP conjugaat zoals beschreven in stap 7,1-7,3. 9. Third Detection Ronde Om het verspreidingspatroon van een 3 transcript detecteren, verder met detectie van antilichaam-hapteen gelabelde probes (stap 5,1 tot 5,4) met behulp van antilichaam-AP conjugaten specifiek voor het 3 hapteen-label. Voeren alkalische fosfatase chromogene kleuring (STEP 6,1-6,5) het aanbrengen van een substraat combinatie die niet was apgetwijnd in de voorafgaande detectie ronden. Kies een chromogene reactie die veroorzaakt kleur precipiteren gemakkelijk te onderscheiden van die van de voorgaande twee detectie rondes (voor de kleurkeuze zie tabel 1). 10. Montage en Imaging Transfer goed gekleurd embryo's tot 30% glycerol in PBS en incubeer tot embryo's volledig zijn gedrenkt in de glycerol oplossing. Ze zijn goed evenwicht gebracht wanneer zij naar de bodem zinken. Transfer embryo tot 70% glycerol in H2O en laat equilibreren bij kamertemperatuur. De gekleurde embryo's kunnen worden opgeslagen in 70% glycerol bij 4 ° C. Voor montage pipet gekleurd embryo's in een 70% glycerol druppel op een object glijbaan en zonder gebruikmaking van de afstandhouders vastgelijmd aan de slede (figuur 3). Breng het deksel slip. Bekijk gemonteerd embryo onder een dissectie microscoop. Verplaats de toegepaste dekglaasje, zodat de embryo's draaien naar de gewenste positie. Goed observerenoriented embryo's met een hoge resolutie (20X, 40X doelstellingen) onder een samengestelde microscoop met Differentieel Interferentie Contrast optiek. Beelden vastleggen met een digitale kleuren camera en besparen op digitaal opslagapparaat.