我们描述在完整果蝇胚胎允许同时和特异性检测的三种不同的mRNA分布模式通过对比色沉淀物多靶生色整个安装原位杂交(MC-WISH)过程。
分析胚胎发育和器官,必须精确地定义如何在不同的基因的表达在空间关系彼此在期间原位活性基因调控网络。多目标生色整个安装原位杂交(MC-WISH)大大方便的基因表达模式的瞬间相比,因为它允许不同的mRNA种类的独特的可视化中相同的样品试样的对比色。这提供了可能性地形涉及基因表达的结构域彼此以高精度和界定独特的和重叠的表达位点。在所提出的协议中,我们描述了比较不同的基因表达模式在果蝇胚胎中一个MC-WISH程序。多达三个的RNA探针,每个特定的另一种基因和标记的由不同的半抗原,被同时杂交的胚胎的样品,随后通过碱检测NE磷酸酶为基础的比色免疫组化。所描述的过程,这里果蝇详细,但同样适用与斑马鱼的胚胎。
原位杂交(ISH)是用于检测和RNA转录的定位在形态学方面,内细胞,组织和生物体1的标准方法。通过原位杂交程序产生的信号通过放射性,荧光和发色检测系统通常可视化。近年来在荧光ISH显著技术进步(FISH)2导致显着提高的灵敏度和分辨率,从而允许检测和RNA表达的定量在单细胞和亚细胞水平和RNA可视至多单个分子3,4。而复杂的单分子的FISH方法用于更专门的应用,显色原位杂交是普遍如在研究和临床诊断原位检测方法的常规的RNA。对于发色检测酶沉淀反应时,能产生明显的产品在网站对比色杂交5。这具有的RNA的可视化可以通过常规的组织学染色和形态学方面进行组合的优点是立即通过标准明显微镜明显。此外,许多应用的彩色基片产生的沉淀物,其是稳定的有机和/或含水安装介质,以便永久样品制剂可以得到5。
在果蝇中,初始ISH协议应用于放射性同位素标记探针检测转录的切片材料6。虽然难以从组织切片以重建整个胚或器官系统的完整转录图案,显色原位杂交程序与非放射性标记的探针的应用使得有可能全局检测核糖核酸分布在全坐骑7。虽然显色原位杂交的许多变型存在,在典型原位杂交(WISH)协议HYB整个安装ridized半抗原标记的探针通过缀合至一个报告酶和mRNA转录由沉淀色原可视抗半抗原抗体检测。
由记者产生不同颜色的沉淀物调色板酶碱性磷酸酶(AP),辣根过氧化物酶(POD),和β-半乳糖苷酶(GAL)允许在一个独特的检测的多个目标和相同的样品8-14。然而,过氧化物酶的活性仅持续有限的时间内和在GAL比色反应有点不太敏感,因此无需额外的(酪酰胺)信号放大15的低丰度转录物的检测可以是用这些酶有挑战性。与此相反,AP的持久活性允许长效基底周转和高信噪比。因此,使用具有不同颜色的底物的AP报告酶序列检测已经证明是成功的,在有效和在单胚胎10-12,16鲜明检测高达三种不同的转录。
对于这种多目标生色WISH(MC-WISH)方法(图1)14,通过体外转录产生并标有可用的半抗原的其中一个标签标记的反义RNA探针。胚胎是甲醛固定和甲醇处理和蛋白酶K消化透。胚胎的杂交同时进行多达三个不同地标记的反义核糖核酸探针的每种特异于不同的基因。除去未结合的探针通过严格洗涤后每半抗原标签可视化在一个单独的一轮检测。单个检测轮由胚胎与抗半抗原抗体耦合到AP和核糖核酸可视化通过施加的AP-基板产生的局部稳定的颜色的沉淀物的温育。抗体检测和染色,所施加的抗体-AP conju后门由低pH值洗涤除去。在多色实验,每轮检测采用靶向不同的半抗原-标记的抗体,每个转录模式由不同的颜色基板(表1)可视化。胚胎被安装在甘油和使用微分干涉对比(DIC)光学高分辨率化合物显微镜下成像。
原位杂交(ISH)与放射性标记的核酸探针通常用于检测RNA的定位上的组织切片。放射性原位杂交的方法,但是很费时间,较不敏感,并且不允许升值的全坐骑完整成绩单分布格局。与此相反,本文中所描述的MC-WISH方法允许多基因表达的结构域在完整的胚胎内的对比色的直接比较。 MC-WISH具有的优点在于组织学方面是立即显而易见的,简单地通过标准明显微镜观察。这提供了可能性地形之间的相互关系以高精度基因表达域和限定在一个快速和可靠的方式独特和重叠的表达位点。另一方面,复用荧光原位杂交(FISH)是更强大的相对于敏感性和分辨率,并优选使用,如果蜂窝或者甚至亚细胞再检测mRNA的溶液是必需的。
转录物的广谱已映射由MC-WISH表明几乎所有转录物,不仅可以在胚胎而且在幼虫和成人组织和物种比果蝇其他被分析。事实上,所描述的过程的详细这里果蝇 ,工作方式类似于高效与斑马鱼胚胎11,16,22。此外,在MC-WISH方法可适应多种无脊椎动物和脊椎动物的胚胎和组织标本的。
半抗原标签和探针浓度
我们经常使用的荧光素,地高辛和生物素的RNA探针的半抗原标签。另外,二硝基酚标记的探针可以应用,已在斑马鱼WISH实验23-25 介绍。荧光素标记的探针显示相较于其它半抗原标记在较小的敏感性,从而使荧光素,最好使用˚F或检测丰富的成绩单。每个新转录探针在一个单一的WISH实验,其中其性能进行了评价或者使用BCIP / NBT或固红作为底物首先测试。探针浓度被认为是最佳的时候没有背景发展提供强有力的信号,在分钟内实现到几个小时。
以确保感兴趣的表达结构域已经在其通过的MC-WISH充分的程度被检测到,它是必不可少的可视化通过使用最敏感的基底结合,BCIP / NBT单标签WISH实验每个转录物的图案。这确保了弱表达结构域在多靶实验不被忽视。为了补偿其他底物组合的灵敏度更低它比标准BCIP / NBT染色必须使用加倍(至三倍)探针浓度。
低pH值失活
在低pH灭活步骤可导致从而减少了在第二和第三轮染色信号检测反义半抗原标记的RNA探针/义mRNA的杂交部分崩解。为了最大限度地减少在灵敏度损失,失活的步骤是尽可能短。我们经历了一个10分钟的培养时间在低pH值足以消除AP-活动。随后迅速洗涤大批量确保迅速稀释的未结合的抗体-AP偶联物和防止再结合到半抗原探针。替代方法包括多聚甲醛固定和热失活。然而,一些颜色析出物不热稳定性和多聚甲醛固定可能不足以对AP的完全失活。第一应用抗体-AP偶联物的不完全的失活可导致重新可视化在下列检测轮导致假阳性重叠在表达与第二mRNA种类待检测的mRNA的图案。因此,在一个对照实验中第Ë胚分成两部分的第一应用抗体-AP偶联物的失活后。第二抗体 – 缀合物的AP从控制级分省略,并且不应当产生在第二颜色反应的信号。然而,如果第二颜色反应产生相应于第一个的信号的分布图案,则灭活过程是没有效率。在这种情况下,在低pH值终止溶液的温育时间应延长为下一个实验。
AP基板应用订单
由于灵敏度下降以后每次轮检测的,最好是之前更丰富的转录检测低丰度的mRNA。此外,固红和固蓝底物组合是显著比purpleblue BCIP / NBT染色不太敏感,从而使快速染料在第一染色轮优选适用于检测强表达转录物。这也可为h作为后续的BCIP / NBT染色可以监测和停止时间的purpleblue信号变得太暗相对于打火机快速染料之前的优点。因此,在一个标准的两色实验,第一强表达的mRNA是通过固红检测和第二较弱的一个由BCIP / NBT。作为替代快速染料的黄色INT底物组合可以应用,然而其产生沉淀物,经过一段时间变得扩散。因此BCIP / INT专门应用在最后一轮染色。因此在三色实验中,我们经常使用的第一个快速红色,第二BCIP / NBT(或快速蓝色)和第三的INT基板结合。注意,最好是施加的INT时尽快拍摄染色的胚胎越好。
荧光检测偶氮染料
它可以是有时难以识别重叠的表达模式,当一个较深的颜色沉淀阴影打火机之一。 F或者例如,强烈发展的BCIP / NBT沉淀会掩盖较轻的快速染料的信号。来解决这个问题的一个方法是将每个染色后立即捕获图像和接下来的检测回合之前除去所施加的颜色的沉淀物。在这种情况下,醇可溶偶氮染料(快速红)和INT沉淀用乙醇洗涤除去所述第一和第二检测回合后 ,分别和BCIP / NBT染色作为最后的AP- 基片26施加。另一种可能性是利用偶氮染料的荧光特性的优势。耐晒大红可以用罗丹明过滤器进行可视化设置27,同时耐晒蓝可以与远红外滤光片28,29可以观察到。比较或生色和荧光图像的覆盖可以揭示共distribution.Using这种方法,BCIP / NBT信号发展的网站已在时间要被停止,以便它不会变得过于致密,淬灭偶氮染料的荧光信号反应产物。
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |