متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em> في الموقع</em> التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة
概要
نحن تصف مولد اللون كله جبل في الموقع التهجين (MC-WISH) إجراء متعدد الاهداف في أجنة ذبابة الفاكهة سليمة مما يتيح كشف في وقت واحد ومحدد من ثلاثة أنماط توزيع مرنا مختلفة المتناقضة رواسب اللون.
Abstract
لتحليل الشبكات التنظيمية الجينات النشطة أثناء التطور الجنيني وتوالد فمن الضروري أن تحدد على وجه الدقة كيف يتم التعبير عن جينات مختلفة في العلاقة المكانية لبعضها البعض في الموقع. متعددة الهدف مولدات اللون كله يشن الموقع التهجين (MC-WISH) يسهل كثيرا من المقارنة الفورية من أنماط التعبير الجيني، كما أنه يسمح التصور مميزة من الأنواع مرنا مختلفة في الألوان المتناقضة في نفس العينة العينة في. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة. في بروتوكول المعروضة، وصفنا إجراء MC-WISH لمقارنة مرنا أنماط التعبير عن الجينات المختلفة في الأجنة ذبابة الفاكهة. ما يصل الى ثلاثة تحقيقات RNA، كل محددة لجين آخر وصفت من قبل ناشبة مختلفة، هي تهجين في الوقت نفسه إلى عينات الجنين والكشف في وقت لاحق من قبل القلويشمال شرق الفوسفاتيز المستندة المناعية اللونية. وترد تفاصيل الإجراء الموضح هنا لذبابة الفاكهة، ولكن يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع الأجنة الزرد.
Introduction
في الموقع التهجين (ISH) هو الأسلوب القياسي للكشف وتوطين النصوص RNA في سياق الصرفي، داخل الخلايا والأنسجة والكائنات الحية 1. الإشارات التي تنتجها الإجراء ISH وتصور عادة من قبل أنظمة الكشف المشعة، فلوري واللونية. في السنوات الأخيرة التقدم التكنولوجي الكبير في ISH الفلورسنت (FISH) 2 أدى إلى تحسن كبير الحساسية والدقة، والسماح للكشف وتحديد الكميات التعبير الحمض النووي الريبي في الخلايا واحدة ومستويات شبه الخلوية والتصور RNA تصل إلى جزيئات واحدة. بينما 3،4 وتستخدم أساليب FISH احد جزيء المتطورة لتطبيقات أكثر تخصصا، ISH مولد اللون على نطاق واسع باعتباره RNA روتيني في طريقة الكشف الموقعي في مجال البحث والتشخيص السريري. للكشف عن مولد اللون تستخدم تفاعلات إنزيم هطول الأمطار، والتي تولد منتجات مرئية في الألوان المتناقضة في المواقعالتهجين 5. وهذا له ميزة أن التصور RNA يمكن دمجها مع البقع النسيجية الروتينية والسياق الصرفي واضحة على الفور من قبل معيار brightfield المجهري. وعلاوة على ذلك، العديد من ركائز اللون تطبق إنتاج الرواسب، التي هي مستقرة في وسائل الإعلام تصاعد العضوية و / أو مائي، بحيث الاستعدادات عينة دائمة ويمكن الحصول على 5.
في ذبابة الفاكهة والبروتوكولات ISH الأولية طبقت تحقيقات المسمى النظائر المشعة للكشف عن نسخة على مواد مقطوع 6. في حين أنه من الصعب إعادة بناء من أقسام الأنسجة أنماط نسخة كاملة من الأجنة بأكملها أو أجهزة الجسم، وتطبيق إجراءات ISH اللونية مع تحقيقات المسمى غير بالإشعاع يجعل من الممكن عالميا لكشف توزيعات RNA في يتصاعد كلها 7. على الرغم من أن العديد من الاختلافات ISH مولد اللون موجودة، في نموذجية كله يشن الموقع التهجين (WISH) بروتوكولات HYB فيتم الكشف عن تحقيقات المسمى ناشبة ridized بواسطة أضداد ناشبة مترافق إلى إنزيم مراسل وتصور النصوص مرنا من قبل مولد اللون عجل.
لوحة من رواسب ألوان مختلفة التي تنتجها مراسل إنزيمات الفوسفاتيز القلوية (AP)، الفجل البيروكسيداز (POD)، وبيتا غالاكتوزيداز (غال) يسمح للكشف المميزة لأهداف متعددة في واحدة ونفس العينة 8-14. ومع ذلك، يستمر POD النشاط الأنزيمي فقط لفترة زمنية محدودة ورد فعل اللونية غال نوعا ما أقل حساسية، بحيث دون إضافية (tyramide) إشارة التضخيم 15 الكشف عن محاضر أقل وفيرة يمكن أن يكون تحديا مع هذه الإنزيمات. في المقابل، فإن النشاط الدائم من AP يسمح طويلة الأمد دوران الركيزة وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ولذلك، كشف متتابعة باستخدام AP مراسل الانزيم مع ركائز ألوان مختلفة وقد أثبتت نجاحا في فعالية وكشف المميز لمدة تصل إلى ثلاثة نصوص مختلفة في الأجنة واحدة 10-12،16.
لهذا متعدد الاهداف WISH اللونية (MC-WISH) طريقة (الشكل 1) 14، يتم إنشاء المسمى تحقيقات RNA العقاقير عن طريق النسخ في المختبر ووضع علامة مع واحدة من العلامات المتاحة ناشبة. الأجنة الفورمالديهايد الثابتة وpermeabilized عن طريق العلاج الميثانول وبروتين K الهضم. يتم تهجين الأجنة في وقت واحد خارج مع ما يصل الى ثلاثة وصفت مختلف تحقيقات RNA العقاقير كل محددة لجينة مختلفة. بعد إزالة التحقيق غير منضم من يغسل التشدد هو تصور كل التسمية ناشبة في جولة منفصلة من الكشف. وتتكون الجولة الكشف عن واحدة من الحضانة الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة الناشبة بالإضافة إلى AP والتصور RNA من خلال تطبيق وAP-الركيزة التي تنتج اللون مستقرة راسب المترجمة. بعد الكشف عن الأجسام المضادة وتلطيخ، وتطبيق الضد-AP conjuتتم إزالة البوابة غسل انخفاض الرقم الهيدروجيني. في تجارب متعددة الألوان، كل جولة من كشف توظف الأجسام المضادة التي تستهدف مختلفة ناشبة التسمية وتصور كل نمط النص من قبل الركيزة لون مختلفة (الجدول 1). هي التي شنت الأجنة في الجلسرين وتصوير تحت المجهر المركب عالية الدقة باستخدام تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الموقع التهجين (ISH) مع المسمى بالإشعاع تحقيقات الحمض النووي غالبا ما يستخدم للكشف عن توطين RNA على أقسام الأنسجة. طريقة ISH المشع، ومع ذلك، هو مضيعة للوقت، أقل حساسية، ولا يسمح التقدير كاملة أنماط توزيع نص في يتصاعد كلها. في المقابل، يسمح الموصوفة هنا طريقة MC-WISH المقارنة المباشرة لعدة مجالات التعبير الجيني في الألوان المتناقضة داخل أجنة سليمة. MC-WISH لديه ميزة هذا السياق النسيجي واضح على الفور وتصور ببساطة عن طريق معيار brightfield المجهري. وهذا يوفر إمكانية لربط مجالات التعبير الجيني الطوبوغرافي لبعضها البعض بدقة عالية وتحديد المواقع التعبير فريدة ومتداخلة بطريقة سريعة وموثوق بها. من ناحية أخرى، ISH الفلورسنت المضاعفة (FISH) هو أقوى فيما يتعلق الحساسية والدقة، ويفضل أن تستخدم، إذا الخلوية أو حتى إعادة الفرعية الخلويةمطلوب حل من الكشف مرنا.
طيف واسع من النصوص التي تم تعيينها من قبل MC-WISH تشير إلى أن تقريبا أي نص يمكن تحليل ليس فقط في الجنينية ولكن أيضا في الأنسجة اليرقات والكبار والأنواع الأخرى من ذبابة الفاكهة. وبالفعل، فإن الإجراء الموضح تفاصيلها هنا لذبابة الفاكهة، ويعمل بكفاءة بالمثل مع الأجنة الزرد 11،16،22. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف طريقة MC-WISH إلى مجموعة واسعة من اللافقاريات والفقاريات الأجنة وعينة الأنسجة.
التسميات ناشبة وتركيزات التحقيق
نحن نستخدم بشكل روتيني فلوريسئين، digoxigenin، والبيوتين كعناوين ناشبة تحقيقات RNA. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق تحقيقات المسمى نيتروفينول التي أدخلت في التجارب WISH الزرد 23-25. عرض تحقيقات المسمى فلوريسئين حساسية أقل بالمقارنة مع غيرها من العلامات ناشبة، لذلك يتم استخدام أفضل أن فلوريسئين وأو الكشف عن محاضر وفيرة. يتم اختبار كل مسبار كتب حديثا لأول مرة في تجربة WISH واحدة، حيث يتم تقييم أدائها إما باستخدام BCIP / NBT أو سريع الأحمر، والركيزة. ويعتبر تركيز التحقيق على النحو الأمثل عندما يتم التوصل إلى إشارة قوية بدون التنمية الخلفية داخل دقيقة لعدد قليل من ساعة.
للتأكد من أن مجالات التعبير عن الاهتمام وقد تم الكشف في الكامل مدى كتبها MC-WISH، فمن الضروري أن تصور كل نمط النص التي كتبها وحيد تسمية التجارب WISH باستخدام مزيج الركيزة الأكثر حساسية، BCIP / NBT. هذا يضمن أن مجالات التعبير ضعيفة لا يغفل في التجربة متعدد الاهداف. للتعويض عن حساسية أقل من تركيبات الركيزة الأخرى لا بد من استخدام الضعف (لثلاث مرات) تركيزات التحقيق بالمقارنة مع معيار BCIP / NBT تلطيخ.
انخفاض الرقم الهيدروجيني تعطيل
الخطوة تعطيل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن يؤدي إلىالتفكك الجزئي من العقاقير المسمى ناشبة الهجينة RNA التحقيق / الشعور مرنا مما أدى إلى انخفاض الكشف عن إشارة في جولات تلطيخ الثانية والثالثة. لتقليل الخسائر في الحساسية، والخطوات تعطيل قصيرة قدر الإمكان. مررنا بها أن فترة حضانة 10 دقيقة في انخفاض الرقم الهيدروجيني يكفي للقضاء على AP-النشاط. يغسل سريعة لاحقة في كميات كبيرة تضمن التخفيف السريع من غير منضم تقارن الضد-AP وتمنع إعادة ملزم للتحقيقات haptenized. وتشمل الإجراءات البديلة تثبيت امتصاص العرق وتعطيل الحرارة. ومع ذلك، فإن بعض رواسب اللون لا حرارة مستقرة وامتصاص العرق التثبيت قد لا تكون كافية لتعطيل كامل للAP. تعطيل ناقصة من الأول التطبيقية الضد-AP المترافقة يمكن أن يؤدي إلى إعادة تصور نمط مرنا في الكشف التالية تؤدي الجولة إلى التداخل ايجابية كاذبة في التعبير مع الأنواع مرنا الثانية التي يتم الكشف عنها. لذلك، في تجربة السيطرة عشريتم تقسيم الأجنة ه إلى تيارين بعد تعطيل أول التطبيقية الضد-AP المترافقة. تم حذف الثاني المترافقة الضد-AP من الكسر السيطرة، وينبغي ألا تنتج إشارة في رد فعل اللون الثاني. ومع ذلك، إذا كان رد فعل اللون الثاني يولد نمط توزيع إشارة المقابلة لأول واحد، ثم كان الإجراء تعطيل يست فعالة. في هذه الحالة، يجب أن تطول فترة حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني الحل محطة للتجربة القادمة.
أوامر AP تطبيق الركيزة
منذ قطرات حساسية مع كل جولة لاحقة من الكشف، فإنه من المستحسن للكشف عن من mRNAs أقل وفرة قبل النصوص أكثر وفرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأحمر السريع والسريع تركيبات الركيزة الزرقاء هي أقل بكثير حساسية من purpleblue BCIP / NBT وصمة عار، بحيث يتم تطبيق الأصباغ سريع ويفضل في الجولة الأولى تلطيخ للكشف عن نسخة أعرب أقوى. هذا أيضا حكما ميزة أن BCIP لاحق / NBT تلطيخ يمكن رصدها، وتوقفت في الوقت المناسب قبل يحصل على إشارة purpleblue مظلمة للغاية فيما يتعلق أخف الأصباغ سريعة. وهكذا في تجربة اثنين من الألوان القياسية، لأول مرة يتم الكشف عن أعربت مرنا أقوى من قبل سريع الأحمر والثانية الأضعف واحدا تلو BCIP / NBT. كبديل لالأصباغ سريعة يمكن تطبيق الصفراء تركيبات INT الركيزة، ولكن الذي ينتج رواسب أن تصبح نشر بعد مرور بعض الوقت. لذلك يتم تطبيق BCIP / INT حصرا في تلطيخ الجولة الأخيرة. ونتيجة لذلك في تجربة ثلاثة ألوان نحن غالبا ما تستخدم سريع أولا الأحمر، BCIP الثاني / NBT (أو الأزرق السريع) والثالث مزيجا الركيزة INT. لاحظ أنه من المستحسن لتصوير الأجنة الملون في أقرب وقت ممكن عند تطبيق INT.
كشف الفلورسنت الأصباغ AZO
قد يكون من الصعب في بعض الأحيان إلى التعرف على الأنماط التعبير المتداخلة عندما قتامة لون راسب والتظليل واحدة أخف وزنا. Fأو سبيل المثال، وضعت بقوة BCIP / NBT راسب يمكن أن تخفي أخف إشارات صبغ سريع. طريقة واحدة للحصول على حل هذه المشكلة لالتقاط الصور على الفور بعد كل تلطيخ وإزالة اللون راسب التطبيقية قبل الجولة كشف المقبلة. في هذه الحالة، يتم إزالتها من الكحول للذوبان الأصباغ صبغ (سريع الأحمر) وINT رواسب من يغسل الايثانول بعد جولات الكشف الأولى والثانية على التوالي، ويطبق BCIP / NBT تلطيخ باعتبارها مشاركة AP-الركيزة 26. والاحتمال الآخر هو للاستفادة من خصائص الفلورية أصباغ الأزو. سريع الأحمر يمكن تصور استخدام فلتر رودامين يحدد 27، في حين الأزرق سريع يمكن ملاحظتها مع مرشحات الحمراء حتى 28،29. المقارنة أو تراكب الصور اللونية والفلورسنت يمكن أن تكشف عن موقع هذا النهج distribution.Using التعاون والتنمية إشارة BCIP / NBT لابد من توقف في الوقت المناسب، بحيث لا تصبح كثيفة جدا وتطفئ إشارة الفلورسنت من صبغ AZO ناتج التفاعل.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Materials
| Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
| NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
| Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
| deionized formamide | Applichem | A2156 | |
| RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
| Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
| Sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
| Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
| Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
| Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
| Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
| Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
| Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
| Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
| Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
| Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
| INT | Sigma | I8377 | |
| NBT | Applichem | A1243 | |
| BCIP | Applichem | A1117 | |
| INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
| Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
| Universal incubator | Memmert | BE400 | |
| Waterbath | Memmert | WB14 | |
| Heat block | Grant | QBT2 | |
| Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
| Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
| 12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |
参考文献
- Hauptmann, G. . In Situ Hybridization Methods. , (2015).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).
- Speel, E. J. Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Hartmann, C., Jäckle, H. Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns. Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).
- Hauptmann, G. Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies. Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).
- Hauptmann, G. One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Methods. 23 (4), 359-372 (2001).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos. Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos. Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).
- O’Neill, J. W., Bier, E. Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes. Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).
- Söll, I., Hauptmann, G., G, H. a. u. p. t. m. a. n. n. Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos. Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).
- Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Multicolor whole-mount in situ hybridization. Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).
- Söll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain. Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).
- Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH. Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).
- Walldorf, U., Gehring, W. J. Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development. Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).
- Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell. 37 (3), 833-841 (1984).
- Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors. Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).
- Hauptmann, G., Gerster, T. Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).
- Long, S., Rebagliati, M. Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes. Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification. Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).
- Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence. J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).
- Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis. J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish. Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).
