Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

En comparación con la estimulación eléctrica convencional, fotoestimulación ofrece una mayor resolución temporal y espacial con una interferencia mínima para el sistema fisiológico de las muestras. Desde la demostración del uso de rayos láser para estimular las neuronas en 1971 ^1, de muchas maneras creativas se han inventado para controlar la actividad neuronal de forma exógena con la luz. Liberación óptico de agonistas photocaged ha sido utilizado para estudiar la respuesta fisiológica de la red neuronal a ligandos ^2,3,4. Esta técnica ha limitado especificidad debido a la difusión de los agonistas enjaulados. Especificidad genética se consigue mediante ectópica expresan canales opsina sensibles a la luz y bombas ^5,6,7, y se ha aplicado con éxito para modular las redes neuronales seleccionadas en diversos organismos modelo. Sin embargo, sería difícil de aplicar este método para controlar ópticamente varias otras proteínas neuronales, ya que el injerto photoresponsiveness de las proteínas opsina a otras proteínas would requerir la ingeniería intenso que puede alterar las características naturales de la proteína en estudio. Químicamente la inmovilización de un ligando exógeno fotosensible a una proteína ha demostrado otra manera de controlar la funcionalidad de proteínas de los canales ^8.9.10. El ligando se presenta o se retira del sitio de unión de la proteína a través de la fotoisomerización de la fracción de azobenceno. Tethering química limita la aplicación principalmente en el lado extracelular de proteínas de membrana, con exclusión de la parte intracelular y proteínas intracelulares.

Photoresponsive Uaas, después de haber sido incorporado en proteínas, proporcionan una estrategia general para manipular las proteínas con la luz. En los primeros esfuerzos, ARNt acilado químicamente con Uaas photocaged con microinyecciones en oocitos de Xenopus para incorporar los Uaas en los receptores de membrana y los canales de iones ^11, que han contribuido a la comprensión de sus relaciones estructura-función ^12,13,14.Este enfoque de microinyección se limita principalmente a grandes ovocitos. Incorporación genética de una Uaa no pasa por el desafío técnico tRNA acilación y microinyección mediante el uso de un par de ARNt / sintetasa ortogonal, que incorpora la SAU a través de la traducción de proteínas endógenas en células vivas ^15,16,17,18. Uaa incorporación en proteínas neuronales se ha demostrado en las neuronas primarias y células madre neurales ^19,20. Más recientemente, photoresponsive Uaa se ha incorporado genéticamente en una proteína neuronal en el cerebro de mamíferos in vivo, por primera vez ^21. Estos avances hacen que sea posible estudiar proteínas neuronales con Uaas en su ambiente celular nativo.

Interiormente rectificación del canal de potasio Kir2.1 es un rectificador fuerte que pasa K ⁺ corrientes más fácilmente en que fuera de la célula, y es esencial en la regulación de procesos fisiológicos incluyendo la excitabilidad celular, el tono vascular, la frecuencia cardíaca, resal flujo final y la liberación de insulina ^22. La sobreexpresión de Kir2.1 hiperpolariza el potencial de membrana de la neurona objetivo, que se hace menos excitable ^23,24. Para controlar ópticamente Kir2.1 en sus células nativas, Kang et al. Incorpora genéticamente un Uaa foto-sensible en Kir2.1 expresa en células de mamíferos, las neuronas y los cerebros de embriones de ratón ^21. Un breve pulso de luz era capaz de convertir la SAU en un aminoácido natural Cys, activando de este modo la proteína Kir2.1 objetivo. Cuando esto dentro rectificación de potasio (PIRK) proteína del canal de foto-inducible se expresa en neuronas de rata primarias del hipocampo, que suprime la activación neuronal en respuesta a la activación de la luz. Además, el canal PIRK se expresó en la corteza cerebral de embriones de ratón, y se midió la corriente PIRK activado por la luz en las neuronas corticales. La aplicación con éxito de la tecnología SAU en vivo en el cerebro de los mamíferos se abre la puerta para controlar ópticamente proteínas neuronalesen su ambiente nativo, lo que permitirá la disección óptica de procesos y mecanismos neuronales a nivel molecular.

En este protocolo se describen procedimientos para la incorporación de genética Uaas en neuronas primarias en la cultura y en el cerebro de embriones de ratón in vivo. El photoresponsive Uaa Cmn y Kir2.1 se utilizan para ilustrar el proceso. Métodos para evaluar el éxito incorporación UAA y control óptico de la actividad de la proteína neuronal se proporcionan. Este protocolo proporciona una guía clara para que codifica genéticamente Uaas en las neuronas y en vivo, y a la regulación de la función de proteínas ópticamente neuronal a través de un Uaa fotosensible. Esperamos que este protocolo para facilitar la adopción de la tecnología in vivo Uaa de la neurociencia y estudios biológicos optogenética.