مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية
概要
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
مقارنة التحفيز الكهربائي التقليدي، ضوئي يقدم أكبر القرار الزماني والمكاني مع الحد الأدنى من التدخل في النظام الفسيولوجي للعينات. منذ المظاهرة استخدام الليزر لتحفيز الخلايا العصبية في عام 1971 1، وقد تم اختراع العديد من الطرق الإبداعية للسيطرة خارجيا نشاط الخلايا العصبية مع الضوء. وقد استخدمت الافراج البصري للمنبهات photocaged فترة طويلة لدراسة الاستجابة الفسيولوجية للشبكة العصبية للجين 2،3،4. هذه التقنية محدودة خصوصية بسبب نشر منبهات قفص. ويتحقق خصوصية الوراثية بالإعراب عن ectopically قنوات أوبسين حساسة للضوء ومضخات 5،6،7، وقد تم تطبيقه بنجاح لتعديل الشبكات العصبية مختارة في الكائنات نموذج متنوعة. ومع ذلك، فإنه سيكون من الصعب تطبيق هذه الطريقة للسيطرة بصريا مختلف البروتينات العصبية الأخرى، منذ تطعيم photoresponsiveness من البروتينات أوبسين للبروتينات أخرى عواد تتطلب الهندسة المكثفة التي قد تغير الخصائص الطبيعية للبروتين قيد الدراسة. الربط كيميائيا ليجند حساس خارجي إلى البروتين وقد أثبتت طريقة أخرى للسيطرة على وظائف بروتينات قناة 8،9،10. وقدم يجند أو سحبها من موقع ملزم من البروتين من خلال الايزوميرة الضوئية شاردة آزوبنزين. الكيمياء الربط يحد من تطبيق أساسا إلى الجانب خارج الخلية من بروتينات الغشاء، باستثناء الجانب داخل الخلايا والبروتينات داخل الخلايا.
Photoresponsive Uaas، بعد أن تدرج في البروتينات، وتوفير استراتيجية عامة لمعالجة البروتينات مع الضوء. في الجهود المبكرة، tRNAs acylated كيميائيا مع وmicroinjected Uaas photocaged إلى البويضات القيطم لدمج Uaas إلى مستقبلات الغشاء والقنوات الأيونية 11، التي تقدمت فهم العلاقات هيكل وظيفتها 12،13،14.ويقتصر هذا النهج حقن مكروي أساسا إلى البويضات كبيرة. التأسيس الجيني للUAA يتجاوز تحديا تقنيا الحمض الريبي النووي النقال أسيلة وحقن مكروي باستخدام زوج الحمض الريبي النووي النقال / مخلقة متعامد، الذي يتضمن UAA عن طريق الترجمة البروتين الذاتية في الخلايا الحية 15،16،17،18. وقد تجلى UAA التأسيس إلى بروتينات الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الأولية والخلايا الجذعية العصبية 19،20. وفي الآونة الأخيرة، تم دمج photoresponsive UAA وراثيا في بروتين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات في الجسم الحي لأول مرة 21. هذه التطورات تجعل من الممكن لدراسة البروتينات العصبية مع Uaas في البيئة الخلوية الأصلية الخاصة بهم.
تصحيح باطنه قناة البوتاسيوم Kir2.1 هو المعدل القوي الذي يمر K + التيارات بسهولة أكبر إلى من خارج الخلية، وأنه من الضروري في تنظيم العمليات الفسيولوجية بما في ذلك استثارة الخلايا، لهجة الأوعية الدموية ومعدل ضربات القلب، وإعادةتدفق الملح نال والأنسولين إطلاق سراح 22. overexpression من Kir2.1 hyperpolarizes إمكانات غشاء الخلايا العصبية المستهدفة، والتي تصبح أقل منفعل 23،24. للسيطرة على بصريا Kir2.1 في الخلايا موطنه الأصلي، كانغ وآخرون. أدرجت وراثيا، صور تستجيب أوا إلى Kir2.1 أعرب في خلايا الثدييات، الخلايا العصبية وأدمغة فئران جنينية 21. وكان نبضة قصيرة من ضوء قادرة على تحويل أوا إلى الأحماض الأمينية الطبيعية السيستئين، وبالتالي تفعيل الهدف البروتين Kir2.1. عندما أعرب عن هذا الصورة محرض تصحيح باطنه البوتاسيوم (PIRK) بروتين قناة في الفئران الخلايا العصبية الأولية الحصين، قمعت إطلاق الخلايا العصبية في استجابة لتفعيل الضوء. وبالإضافة إلى ذلك، أعرب عن قناة PIRK في القشرة المخية الحديثة الماوس الجنينية، وتم قياس PIRK الحالية تفعيلها للضوء في الخلايا العصبية القشرية. التنفيذ الناجح للتكنولوجيا UAA في الجسم الحي في أدمغة الثدييات يفتح الباب للسيطرة على بصريا بروتينات الخلايا العصبيةفي بيئتهم المحلية، الأمر الذي سيمكن تشريح البصرية من العمليات والآليات العصبية على المستوى الجزيئي.
في هذا البروتوكول وصفنا إجراءات التأسيس الجيني للUaas في الخلايا العصبية الأولية في الثقافة وفي مخ الفأر الجنينية في الجسم الحي. وتستخدم photoresponsive UAA CMN وKir2.1 لتوضيح هذه العملية. طرق لتقييم نجاح التأسيس UAA والسيطرة البصرية من نشاط البروتين الخلايا العصبية يتم توفيرها. هذا البروتوكول يوفر دليلا واضحا على ترميز وراثيا Uaas في الخلايا العصبية وفي الجسم الحي، وتنظيم بصريا وظيفة بروتين الخلايا العصبية عن طريق UAA photoresponsive. ونحن نتوقع هذا البروتوكول لتسهيل اعتماد تكنولوجيا في الجسم الحي أوا لعلم الأعصاب وعلم البصريات الوراثي الدراسات البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحقيق فعال الصورة التشكيل، فإن الخطوة الأولى المهمة هي أن تقرر أين دمج UAA photoresponsive في البروتين المستهدف. المعلومات الهيكلية والوظيفية للبروتين المستهدفة هي مفيدة جدا لتوجيه اختيار المواقع المرشحة. وفي الوقت نفسه، فإن الغرض من التنظيم ضوء تحديد الموقع الذي هو الأكث?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
参考文献
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. 生化学. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 神経科学. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
