概要

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Published: March 05, 2016
doi:

概要

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

In vitro birincil hipokampal nöronları Kültürleme nöronal gelişimi birçok yönlerini mekanik sorgulama kolaylaştırır. Ayrışmış embriyonik hippokampal nöronlar, genellikle, serum içermeyen koşullar altında, yüksek yoğunlukta cam lameller üzerine başarılı bir şekilde büyüyebilir, ancak düşük yoğunluklu kültürleri, tipik ederek trofik faktöre kaynağı gerektirir zaman alıcı olabilir hazırlanması bunun bir glia besleyici tabaka ile ortak kültür ve zahmetli. Buna ek olarak, glia varlığı nöron spesifik mekanizmalarına sonuçları ve preclude çalışmaların yorumlanmasına neden olabilecek. Burada basitleştirilmiş bir yöntem serumsuz koşullar altında ve glial hücre desteği olmadan bir ultra-düşük yoğunluklu (~ 2.000 nöronlar / cm2), uzun dönemli (> 3 ay) primer hipokampal nöron kültürü için sunulmuştur. Düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı lamelleri yetiştirilen ve 24 oyuklu bir plaka içerisinde yetiştirilen yüksek yoğunluklu nöronlar üzerinde ters çevrilmiş olan. Bunun yerine betwee bir alan oluşturmak için parafin nokta kullanarakn İki nöron katmanları, deneyci sadece düşük yoğunluklu nöron büyümeye elverişli bir MICROSPACE oluşturmak için, yüksek yoğunluklu nöronlar ikamet hangi kuyunun plastik altını, etch olabilir. ko-kültür böylece kolayca bu nöronların morfolojik ve fizyolojik çalışma kolaylaştıran düşük yoğunluklu nöronların önemli bir kayıp olmadan> 3 ay muhafaza edilebilir. Bu başarılı kültür koşulundaki göstermek için, veri uzun süreli kültürden sonra, düşük yoğunluklu hücrelerinde bol sinaps oluşumunu göstermek için verilmiştir. Bu eş-kültür sistemine, aynı zamanda, poli-D-lizin substratlar ve böylece autaptic bağlantıların oluşumu adaları yetiştirilen seyrek bireysel nöronların hayatta kalmasını kolaylaştırır.

Introduction

In vitro koşullarda hipokampal nöronlar Büyüyen gözlem ve in vivo olarak başka türlü mümkün olmayan bu nöronların deneysel manipülasyon sağlar. Bu deneysel yaklaşım yaygın büyüme, kutuplaşma, akson şartname, insan ticareti ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, sinaps oluşumu ve işlevsel olgunlaşma 1 nöronal mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Geç embriyonik aşamada hasat zaman Bu in vitro kültür hipokampal nöronlar, piramidal morfoloji 2 (>% 90) glutamaterjik hücreler nispeten saf bulunmaktadır. Nöronlar in vitro koşullarda bir 2-D yüzeyinde yetişen Çünkü, bu yöntem tek bir odak düzlemi 3 ile boyama gibi canlı görüntüleme veya immünsitokimya (ICC) kolay gözlem, izin verir; Böyle ilaç tedavisi ve transfections 3-6 veya manipülasyonlar. yüksek yoğunlukta yetiştirilen zaman, nöronlar, çünkü daha yüksek co hayatta kalma yüksek oranlarına sahip olma eğilimibüyüme ortamından, ve aynı zamanda çünkü akson temas bağımlı mekanizmalar 7 sindirim desteğinin yanı sıra salgılanan büyüme faktörlerinin ncentrations. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu hipokampal nöronlar bağımsız bir nöron bütünüyle görüntülenecek veya ICC analizi için boyandı morfolojik çalışmalar için de arzu edilir. Düşük yoğunluklu nöronlar nedeniyle parakrin destek eksikliği nedeniyle kültüründe korumak zor ve bu nedenle sık sık önceki nöron kültürü 2 hazırlıklı olmak olan bir glial (genellikle kortikal astrosit) besleyici tabaka, gelen trofik desteği gerektirir. Bir glial hücre besleyici tabaka ile kültürlü işbirliği yaparken, düşük yoğunluklu nöronlar lamelleri yetiştirilen ve düşük yoğunluklu nöronlar ve glia birbirine bakacak şekilde daha sonra glia tabakasının üstüne çevirdi. Glia ve nöronlar arasındaki küçük bir kapalı alan, bu nedenle bir 'sandviç' düzen 2,8,9 yaratma, lamelleri köşelerindeki parafin noktalar yerleştirerek oluşturulur. düşük yoğunluklu nöronlar w büyüyecekglia ve nöronlar ve glia tarafından salgılanan konsantre faktörler ile bir müsamahakar mikro oluşturur lamel arasında kapalı alana ithin. Bu yaklaşım, düşük yoğunluklu, makul aralıklı olan tam gelişmiş nöronlar, bu nedenle kolaylaştırma ICC etiketleme ya da canlı görüntüleme çalışmaları verir.

yana zaman alıcı ve zahmetli olmaktan nöron glia ortak-kültürünün bir görünür sakıncası, bu nörona özgü veya hücre-bağımsız, düzenekleri önlemesidir. Bu sistem çok daha az karmaşık daha olmasına rağmen in vivo sinir dokusu, deneyler 10 bulandırabilir salgılanan, zaman henüz tam olarak tanımlanmış faktörleri ile nöron gelişimi üzerindeki glia etkisi. Bu nedenle, nöron spesifik mekanizmaların soruşturma, serum ve glial destek tabakası gerekli kaldırmak tanımlanan kültür koşulları gerektiren deneylerde. Bir önceki çalışmada, bir inci kullanılarak nöronların düşük konsantrasyonlarda (~ 9.000 hücre / cm 2) kültüre başarmıştırree boyutlu hidrojel matrisi 11. nispeten saf nöronal popülasyon glial desteksiz serumsuz koşullar altında, yüksek yoğunlukta kültürlenebilir yana, hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu ile serumsuz tanımlanmış bir kültür ortamı içinde yetiştirilen Hipotezimize olarak, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür geleneksel olarak kabul nöron glia ko-kültür benzer bir şekilde. Gerçekten de, bir "sandviç" yapılandırmada, yüksek yoğunluklu hipokampal nöron kültürleri en son özel magnoselüler endokrin nöronlar 12 az sayıda destek kullanılmıştır.

Bu nedenle, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür düşük yoğunluklu nöronlar uzun süreli sağkalım sağlamak için yeterli trofik faktörler destek almak için izin verebilir. kültür ultra-düşük yoğunluklu nöronların Bu protokol, böylece formüle ve onaylanmıştır. protokol yüksek yoğunluklu hazırlayarak, tek bir deneyde içinde uygulanabilir (~ 250.000 hücre / ml) disBirlikte olan hippokampal nöronlar, önce ve sonra bir yoğunluğa ~ 10,000 nöronlar vermek üzere bir seyreltme yapılmadan / ml (~ 3000 nöronlar / lamel veya ~ 2.000 nöron / cm2), en düşük yoğunlukta kültür bildirilen daha düşüktür, 2,3,9 , 11,13. Bu kültür durum gevşek 'ultra-düşük yoğunluklu' kültür olarak adlandırılan ve 'düşük yoğunluklu' arası istikrarsızca kullanılır. yüksek yoğunluklu nöronlar, poli-D-lisin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine plakalanır; düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı 12 mm'lik cam lameller üzerine ekildi ise başka bir 24-çukurlu plaka içinde yerleştirilir. nöronlar indiler ve lamelleri bağlı sonra düşük yoğunluklu nöronları yapışmış olan lamelleri 2 saat sonra yüksek yoğunluklu nöronların üstünde çevrileceği. Buna ek olarak, bunun yerine yüksek yoğunluklu nöron katman üzerinde lamelleri yükseltmesine parafin noktalar kullanılarak, bir 18 G şırınga iğnesi, iki paralel çizgi 24 yuvalı plakalar alt aşındırma için kullanılmıştır. Ortaya çıkan displNahl.Acad, bitişik plastik cam lamelleri için yükseltilmiş bir destek sağlar. Bu alan sürekli konsantre trofik faktörler ile mikro sağlarken yeterli oksijen ve kültür ortamı alışverişini sağlayan 150-200 mikron, ölçülür. Bu durumda, düşük yoğunluklu nöronlar yoğun büyür ve kültürde üç ay ötesinde yaşayabilir. Bu nöronlar kültüründe üç hafta sonra GFP plazmid ile transfekte edildiğinde, dendritler bolca dendritik dikenler çivili. ilkesinin bir kanıtı olarak, veriler, bu ko-kültür sistemi nöronları hücre araştırma kolaylaştırabilir autaptic bağlantıları oluşturan poli-D-lizin mikro-adalar ", üzerine ekildi hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu kültürleri desteklediğini göstermek için sunulmuştur -autonomous, ağ-bağımsız mekanizmalar.

Protocol

fareler içeren tüm deneysel prosedürleri Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan ve NIH kurallarına uyduğu bulundu. Hipokampal Nöron Kültürü 1. Doku Kaynağı Hipokampal nöron kültürü için prenatal fare yavrular üretmek için evi 17 yetiştirilen zaman gebe farelerin (C57BL6 / J) kullanın. vajinal fiş algılama ile gün E0.5 olarak belirlenmiştir. kültür için planlanan hasat zamanı E16.5-E17.5 olduğun…

Representative Results

Burada açıklanan protokol besleyici tabakası olarak hizmet eden glial hücreler gerek olmadan başarılı ultra düşük yoğunluklu saf glutamaterjik nöronların uzun dönemli kültür sağlar. Protokol bu ayrı ayrı (poli-D-lizin kaplı cam lameller üzerine) (24 kuyu kaplanmış poli-D-lisin ile) yüksek yoğunluklu hazırlanmasını ve düşük yoğunluklu nöronları içeren, Şekil 1 'de diagramed, ve daha sonra eş-kültür edilir üç aya kadar muhafaza …

Discussion

Serum içermeyen koşullar altında, ultra düşük yoğunluklu hipokampal glutamaterjik nöronların uzun süreli kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. ~ 2000 nöronlar / cm 2, yoğunluk ya da mevcut literatüre 2,3,11,13,14 tarafından bildirilen glia desteği olmadan en 'düşük yoğunluklu' kültür hazırlıkları kat daha en az iki düşüktür at. ultra düşük yoğunluklu olmasının yanı sıra, bu protokol, yeni ve iki yönden önemlidir. düşük yoğunluklu nöronla…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).

Materials

Neurobasal medium Life Technologies 21103-049 Protect from light
B27 supplement Life Technologies 17504-044 aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I Life Technologies 35050-061 dilute 100X 
antibiotic-antimycotic (AA) Life Technologies 15240-096 dilute 100X 
Complete Culture medium Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium same as 'Neurobasal medium'
Feed medium Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 M.W. 70000-150000
borate buffer Sigma-Aldrich B6768 (boric acid); 71997(borax) 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH 1001/12 No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit Promega E1200 see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS) Promega E1200 see  protocol for details
Syringe filter Pall Corporation 4192 0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit Qiagen 12362 for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody Millipore MAB3418 mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody Millipore AB10417 rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody Millipore MAB1586 mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody Millipore AB1504 rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution ThermoFisher 14025092 500ml size

参考文献

  1. Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
  4. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
  5. Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
  6. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
  7. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
  8. Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
  9. Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
  10. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
  11. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  12. Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
  13. Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
  14. Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
  15. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  16. Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
  17. Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).

Play Video

記事を引用
Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. J. Vis. Exp. (109), e53797, doi:10.3791/53797 (2016).

View Video