Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Crescer neurónios do hipocampo em condições in vitro permite a observação e manipulação experimental desses neurônios que de outra forma não seriam possíveis in vivo. Esta abordagem experimental é amplamente utilizado para revelar os mecanismos neuronais de crescimento, polaridade, especificação de neurites, tráfico e localização subcelular das proteínas, a formação de sinapses e a maturação funcional ^1. Estes neurónios do hipocampo em cultura in vitro, quando colhido de estágios embrionários tardios, são relativamente pura (> 90%) de células glutamatérgicas morfologia piramidal ^2. Uma vez que os neurónios foram cultivados em uma superfície 2-D sob condições in vitro, este método permite a fácil observação, tais como imagens ao vivo ou imunocitoquímica (ICC) a coloração por meio de um único plano focal ^3; ou manipulações, como o tratamento de droga e transfecções ^3-6. Quando cultivadas em alta densidade, os neurônios tendem a ter altas taxas de sobrevivência por causa de maior concentrations de factores de crescimento segregados em adição ao suporte alimentar a partir do meio de crescimento, e também por causa dos mecanismos dependentes de contacto ⁷ de neurites. No entanto, de baixa densidade neurônios do hipocampo são desejáveis ​​para estudos morfológicos, onde um neurônio individual podem ser visualizados na íntegra ou manchados para análise ICC. Neurônios de baixa densidade são difíceis de manter na cultura devido à falta de apoio parácrina e, portanto, muitas vezes necessitam de suporte trófico de uma camada de alimentação glial (tipicamente cortical astrócitos), que tem de ser preparada antes da neurônio cultura ^2. Quando co-cultivadas com uma camada alimentadora de células gliais, os neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas, e, em seguida, invertida por cima da camada de células da glia para que os neurónios e glia de baixa densidade estão voltadas uma para a outra. Um pequeno espaço confinado entre as células da glia e os neurónios é criado colocando pontos de parafina sobre as esquinas das lamelas, por conseguinte, a criação de um layout "sanduíche" ^2,8,9. Os neurónios de baixa densidade aumentará Within o espaço confinado entre glia e as lamelas, o que cria um microambiente permissivo com fatores concentrados secretados pelos neurônios e células gliais. Esta abordagem resulta de baixa densidade, os neurônios totalmente desenvolvidos que são espaçados razoavelmente distante, rotulagem ICC, portanto, facilitar ou estudos de imagem ao vivo.

Uma aparente desvantagem de co-cultura neurônio-glia, além de ser demorado e trabalhoso, é que ele impede estudo da específicos de neurónios ou células-autônoma, mecanismos. Embora este sistema é muito menos complexo do que in vivo do tecido neural, impacto glia em neurônio desenvolvimento através secretadas, fatores não-ainda-completamente-definidos podem confundir as experiências ^10. Portanto, em experiências que requerem a investigação dos mecanismos específicos de neurónios, as condições de cultura definidas que remover o soro e a camada de suporte da glia são necessárias. Um estudo anterior teve sucesso na cultura de baixas concentrações de neurónios (~ 9.000 células / cm ²⁾ usando um thmatriz de hidrogel dimensional ree ^11. Uma vez que uma população de neurónios relativamente puro pode ser cultivado a elevada densidade, sob condições isentas de soro, sem apoio da glia, que a hipótese de que ultra-baixa densidade de neurónios do hipocampo pode ser cultivada em meio de cultura isento de soro definido por co-cultura destas com neurónios de alta densidade, em uma forma que é análogo ao processo de co-cultura neurónio-glia convencionalmente adoptada. Com efeito, a alta densidade de hipocampo de culturas de neurónios em uma configuração "sandwich" têm sido recentemente utilizadas para suportar um pequeno número de neurónios magnocelulares endócrinas especializadas ^12.

Portanto, co-cultura com os neurônios de alta densidade podem permitir que os neurônios de baixa densidade para receber fatores suporte trófico que seja suficiente para permitir a sobrevivência a longo prazo. Este protocolo de neurônios ultra-baixa densidade de cultivo foi assim formulado e validado. O protocolo pode ser implementada dentro de uma única experiência, através da preparação de alta densidade (~ 250000 células / ml) de disneurónios do hipocampo sociada em primeiro lugar, e, em seguida, fazer uma diluição para se obter uma densidade de ~ 10.000 neurónios / mL (~ 3.000 neurónios / lamela, ou ~ 2.000 neurónios / ^cm2), que é muito mais baixa do que a maioria relatado culturas de baixa densidade ^{2,3,9 , 11,13.} Esta condição cultura é vagamente referida como cultura "ultra-baixa densidade" e utilizada com "baixa densidade" inter-changeably. Os neurónios de alta densidade são plaqueadas em poli-D-lisina revestidas placas de 24 poços; enquanto que os neurónios de baixa densidade são semeadas em lamelas de vidro de 12 mm revestidas com poli-D-lisina, que são colocados dentro de outra placa de 24 poços. As lamelas com aderindo neurónios de baixa densidade são viradas na parte superior dos neurónios de alta densidade de 2 horas mais tarde, após os neurónios são descidos e ligado às lamelas. Além disso, em vez de utilizar pontos de cera de parafina para elevar as lamelas acima do neurónio da camada de alta densidade, uma agulha de seringa de 18 G foi utilizada para gravar o fundo das placas de 24 poços com duas tiras paralelas. O displ resultanteACED, plásticos adjacentes fornecer um suporte elevado para as lamelas de vidro. Este espaço é constantemente medido a 150-200 mm, o que permite a troca de oxigênio e meio de cultura suficiente, proporcionando um microambiente com fatores tróficos concentradas. Sob esta condição, os neurônios de baixa densidade crescer extensivamente, e pode sobreviver mais de três meses em cultura. Quando esses neurônios são transfectadas com plasmídeo GFP após três semanas em cultura, os dendritos são profusamente ornamentada com espinhas dendríticas. Como prova de princípio, os dados são apresentados para mostrar que este sistema de co-cultura suporta culturas ultra-baixa densidade de neurônios do hipocampo semeadas em poli-D-lisina "micro-ilhas", onde os neurônios formam conexões autaptic que podem facilitar a investigação de células , mecanismos -autonomous de rede independentes.