Система / cas9 CRISPR предлагает потенциал, чтобы сделать редактирования целенаправленный генома доступной для научного сообщества. Этот протокол предназначен для демонстрации того, как создать вирусы, которые будут с выбыванием представляющий интерес ген, используя систему CRISPR / cas9, а затем применить их стереотаксическим в мозг взрослых мышей.
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
Изучить основы нормальной физиологии и патологии болезни, существует необходимость точно манипулировать экспрессии генов в модельных организмах. Для модельных организмов млекопитающих, это в значительной степени сосредоточены на создании и развитии трансгенных мышей, в которых генетический элемент, представляющий интерес, в окружении сайтов, признанных рекомбиназы. Это может привести к участкам, манипулирование этими генами фланкированные. Хотя это была успешная стратегия, настало время и ресурсоемким; например, создание тройной трансгенного животного, которое выражало бы floxed ген, Cre рекомбиназу и ген-репортер Cre требует многократных спариваний и проверки. В противоположность этому , стереотаксической инъекции репликации дефектных вирусных частиц , кодирующие флуоресцентный белок и рекомбиназу в floxed гена животного не требует сложного генотипирование или стратегий разведением 1. Кроме того, если флуоресцентный белок и Cre экспрессирующих вирус совместно вводят со вторым вирусом ENCOдинь другой флуоресцентный белок, то это обеспечивает контроль внутри ткани-мишени для генетических манипуляций. В то время как эта стратегия по-прежнему требует использования нокаута в животных, вирусно опосредованные стратегии РНК на основе обойти потребность в трансгенных животных. Например, стереотаксической инъекции репликации с дефицитом вирусов, которые кодируют флуоресцентный белок и короткий шпилька РНК (shRNA) могут использовать эндогенные RNAi оборудование ячейки приведет к мощному снижению транскрипта гена. Тем не менее, стратегии shRNA производят тонкие ген нокдаунов часто приводит к скромных клеточных фенотипов 2. В то время как нокдауна может быть более физиологически актуально для гетерозиготной дисфункции гена, его уменьшилась прочность по сравнению с нокаута не является идеальным для фенотипического открытия новых генов.
Третий метод, который недавно появился, то CRISPR (Кластерный Регулярно Interspaced Короткие палиндромных Repeat) / cas9 (CRISPR-ассоциированныйбелок 9) система, опирается на экспрессию как небольшой экзогенной РНК и режущим ДНК фермента. Система / cas9 CRISPR был адаптирован из прокариот иммунной системы , которая эволюционировала способ идентификации иностранных, вторгаясь ДНК от вирусов и ориентации его на деградацию с помощью фермента cas9 3,4. Этот мощный метод редактирования генома может быть использован для создания целевых делеции, инсерции и мутации; и следующий протокол будет кратко описано , как сделать делеции в гене интереса для того , чтобы с выбыванием свое выражение в естественных условиях. Фермент cas9 должен быть выражен с направляющей РНК , гомологичные области , представляющей интерес и смежных с подмостей РНК. Нокаут гена с помощью этого метода требует ориентации cas9 для конкретного региона в геноме с использованием синтетических направляющих РНК (sgRNA), и вызывая двухцепочечные разрывы (DSBs) на сайте интерес. Эти DSBs затем ремонтироваться эндогенного клеточно-ремонтной техники через негомологичный конечного присоединения (NHEJ), который леобъявления вставкам , которые могут производить миссенс или нонсенс – мутации и , следовательно , может создать потерю экспрессии функционального белка 5. Так как эта система производит геномные изменения, он требует только временной экспрессии cas9 и sgRNA. Тем не менее, желательно, чтобы стабильная флуоресцентного индикатора для идентификации клеток и их потомство манипулируют таким образом.
Lenti- и ретровирусы имеют преимущество стабильно интегрировать интерес ДНК в клетки-хозяева, которые поддерживают долгосрочное выражение и которые передаются дочерним клеткам во время митоза. Этот протокол описывает конструкцию и производство двух типов репликации дефектной, высокий ретровирусов титром: вирус иммунодефицита человека, полученные лентивирусов частицы (лентивирусные) и те, которые основаны на мышиной лейкемии Мэлони вируса (ретровируса). В то время как оба из этих вирусов способны поддерживать стабильный выражения больших трансгенов, ретровирусные частицы могут включать только в геном дюделение клеток кольцо с деградацией ядерной оболочки, и , следовательно , может быть использован в качестве инструмента для обозначения и дата рождения 6 ячеек. В то время как лентивирусов имеют репутацию относительно низкий титр 7, эта методология, в том числе использование кофеина 8 во время вирусной коллекции, обычно производит титры 10 9 и 10 10 частиц / мл. Еще одно преимущество lenti- и ретровирусов является допуском для очень больших вставок. Следующий сборник протоколов описывает процедуру для разработки Ленти или ретровирус, кодирующий флуоресцентный репортер, sgRNAs и cas9, чтобы использовать систему CRISPR / cas9 модифицировать ДНК, а также выразить флуоресцентный белок.
Мышь стереотаксической нейрохирургии является ценным методом для инъекций вирусов в естественных условиях для изучения морфологии, функции и связность инфицированных нейронов. Вирусные инфекции в нейронах могут быть использованы для манипулирования уровнями экспрессии в течение длительного периода ТИМае, такие, как в ходе развития, и выражение можно точно контролировать путем использования различных лекарственных индуцируемых систем и специфической ведомой экспрессии Cre. Этот конкретный протокол объясняет, как внедрить вирус, экспрессирующие sgRNA и cas9 нокаутировать представляющий интерес ген в мозге взрослого мыши. Мыши восстанавливаться очень быстро от этой процедуры и экспрессии вирусных трансгенов можно увидеть в течение 48 часов после инъекции. Тем не менее, флуорофор выражение, как представляется, увеличиваются в течение нескольких недель, в результате вблизи максимальных уровней на 3 недели после заражения. Мыши, которые претерпевают вирусный стереотаксической инъекции могут быть использованы для поведения, электрофизиологии или морфологических исследований. В целом, цель этих процедур заключается в демонстрации того, как нокаутировать ген в мозге взрослых мышей с помощью стереотаксической хирургии и вирус, выражающую определенную sgRNA и cas9.
Есть несколько важных шагов, которые имеют важное значение для успешной вирусной упаковки. здоровье Ячейка имеет решающее значение до и во время трансфекции, как нездоровое клетки значительно уменьшит количество вируса производится. Если трансфекцию и упаковки успешны, то 100% клеток должны выразить флуорофора и клетки должны образовывать функциональный синцитий. На шаге 3.2.4, коснувшись трубу необходимо для высокого титра трансфекцией эффективно, и рН HEPES-буферном солевом растворе, должно быть точным. Макси-Preps, которые производят плазмид, необходимые для вирусной упаковки должны быть очень чистыми. С этой точки, полезно в этанол осадить окончательное элюирование ДНК и повторно приостанавливать в буфере Трис-ЭДТА. Кроме того, очень важно, чтобы уменьшить количество сыворотки на 2% или менее, в средствах массовой информации о том, что кофеин добавляется к на 6-й день (этап 3.4) перед вирусной коллекции. Если сыворотка не уменьшается, а затем окончательно очищенный вирус будет содержать нежелательный количество сыворотки PROTEin. Применение полиэтиленгликоля 6000 при осаждении вирусных частиц исключает необходимость ультрацентрифугирования. Важно также отметить, что cas9 CRISPR, содержащие вирусы, как правило, имеют титр около 10 раз меньше, чем вирусы, содержащие только флуорофор.
Для стереотаксической хирургии, использование вдыхаемого анестезии позволяет быстро и точно контролировать или сознание животного по сравнению с инъекционными анестетиков и позволяет анестезии в более широком диапазоне возраста. Очень важно, чтобы держать хирургические инструменты чистыми и стерильными, и воспроизводимое нацеливание требует точного позиционирования головки. Убедитесь, что нет качка или прокатка головы в стереотаксической инструмента и что череп чувствует себя твердо на месте. Это может быть полезным, чтобы позволить череп высохнуть, чтобы найти швы, чтобы определить стереотаксической координаты. Кроме того, скорость и объем для каждого стереотаксической координат должны быть определены эмпирически.
Этот метод ограничивает в том, что распространение в lenti- или ретровируса ограничено, особенно по сравнению с аденосателлитные вирусами (AAVs) .Therefore, эти вирусы являются ценными при заражении дискретную область мозга, но не для общей инфекции, связанные с AAVs используется для анализа поведения у животных. Использование кофеина в этом протоколе значительно повышает титр этих вирусов, но они все еще не так высок, как титрами, достигнутыми в AAV упаковке. Кроме того, стабильная интеграция является лишь преимуществом выражения флуорофора, так как CRISPR / cas9 образует стабильные геномные редактирует даже при трансфицированы, и возможно, что продолжающийся экспрессию cas9 и sgRNA могут в конечном счете привести к возникновению посторонних целевых эффектов. Переходная выражение CRISPR / cas9 система с AAVs достаточно для получения геномных изменений, которые распространяются по всему клеточных делений, тем не менее, экспрессия флуорофор не будет поддерживаться.
Создание Lenti- и ретровирусы, использующие / системы cas9 CRISPR будет придавать способность обнаружить любую новый ген в самых разнообразных организмов. Эффективность редактирования гена по-видимому, зависит от последовательности направляющей РНК, нацеленной на расщепление cas9. Эмпирически было установлено, что от 10% до 80% клонов содержат вставкам после того, как секвенирование инфицированных клеток Neuro2A. Это в настоящее время неизвестно, будет ли INDEL частоты, вычисленные в клетках Neuro2A отражают те, в нейронах. Руководство РНК разработки программного обеспечения, такие как Benchling в настоящее время включают в себя "на-мишень" счет, который может быть в состоянии предсказать эффективность данной целевой последовательности. В какой степени такие "по-мишени" забивает надежные потребности быть определены эмпирически в нейронах и других типов клеток, как система CRISPR-cas9 становится все более широко реализуются.
Лентивирус на основе трансгенных животных было успешным переменно с сообщениями, что лентивирусов доставляемого трансгены стать сиlenced 11. CRISPR редактирование опосредованной ген ДНК может быть пропущен через зародышевую линию, чтобы генерировать целые модели на животных. Таким образом, стабильная геномная редактирования может быть достигнута, несмотря на замалчивания вирусными доставляемого флуорофоров и cas9 трансгенов. Это может обеспечить эффективную платформу для целевых геномных изменений. Вирусный поставка CRISPR системы / cas9, в то время как не требующий трансгенных организмов, является дополнением к этим методам. Например, потребители инъекционных таких вирусных частиц в соединение трансгенного животного, которое индуцибельно выражающего Cre и Cre зависимой опто- или химио-генетический трансгены должны способствовать комплексные исследования в взаимосвязи между генетическими манипуляциями и нейронную активность. Вторым примером является доставить эти вирусные частицы cas9 / sgRNA в условном нокаута в попытке скрининга для генно-генных взаимодействий. И, наконец, еще один захватывающий маршрут этого исследования является скрининг фенотипов и терапевтических соединений в клетках пациента происходит, что можетиспользоваться для проверки и обнаружить генетические сети, которые нарушаются при различных заболеваниях.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Нинь грант R01MH097949 и Аутизм Говорит Pilot Грант 7359 до BWL и Норрис хлопок онкологического центра оптических изображений Shared Инструментарий Грант P30CA023108.
List of Cell Culture Reagents | |||
293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
List of Transfection Reagents | |||
5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
(Na2HPO4) | |||
2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
filter and store at 4°C | |||
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
Stereotaxic Surgery Reagents | |||
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
Isoflurane | |||
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 |