Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli sono stati approvati dai Dartmouth Istituzionale biosicurezza e istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa revisione da stiro. 1. Protocollo per la progettazione di una guida Strand (sgRNA) per CRISPR / Cas9 Retrovirus NOTA: Ci sono molti siti web senza scopo di lucro che possono essere utilizzati per generare sgRNAs per indirizzare un gene di interesse (https://benchling.com/ e http://crispr.mit.edu/). L'obiettivo di questo protocollo è quello di creare e ordinare singoli oligonucleotidi bloccati da un fornitore commerciale che sono ricotto gli uni agli altri. Questo oligo ricotto verrà ligato nel vettore di trasferimento PXL. Guarda il video supplementare 1 per un esempio di progettazione sgRNAs utilizzando Benchling. Utilizzare un sito web dedicato alla progettazione sgRNAs. NOTA: Per esempio, inserendo una codifica / sequenza exonic da vicino all'inizio del gene di interesse nel sito web genererà un sgRNA 20 nucleotidi. Utilizzare la sequenza nucleotidica sgRNA 20 per progettare il senso e antisenso oligos che verrà ordinato per creare il sgRNA. Dopo aver generato il sgRNA, copiare questa sequenza in un word processor. Aggiungere una G (guanina) all'inizio della sequenza nucleotidica sgRNA 20 nel documento, se non è già inizia con uno (cioè, G-20 sequenza nucleotidica sgRNA). Ciò è necessario per assicurare una buona trascrizione off promotore U6. Documentare il complemento inverso di questa ora 20-21 sequenza nucleotidica. Per l'oligo senso, aggiungere "CACC" per l'estremità 5 'della sequenza nel documento (cioè, CACC-G-20 sequenza nucleotidica sgRNA). Questa sporgenza viene utilizzata per legare la sequenza nel vettore PXL. Per l'oligo antisenso, aggiungere AAAC alla 'fine 5. Utilizzare questo sbalzo di legare la sequenza nel vettore PXL. Ottenere i oligonucleotidi senso e antisenso. Dopo aver ricevuto i oligonucleotidi, fare 100 micron scorte utilizzando DNAsi acqua libera. Mescolare 10 ml ciascuno dei 100 micron senso e antisenso oligonucleotidi con 4 μl di 10x NEB Buffer 2, e 16 ml di acqua. NOTA: Non hanno bisogno di purificazione pagina o 5'phosphorylation (come gli sbalzi BBSI sono estremità coesive non compatibili). Portare 200 ml di acqua a bollire in un bicchiere da 500 ml, poi galleggiare il tubo contenente il composto in una schiuma detentore "floater". Consentire l'acqua per raffreddare lentamente da 95 ° C per 2 ore a temperatura ambiente. Diluire il mix ora ricotto-oligo 1: 1.000 in acqua sterile ed utilizzare immediatamente seguente legatura o conservare la reazione rimanente a -20 ° C. Digest PXL, un derivato PX330 vettore, con l'enzima di restrizione BBSI a 37 ° C per 2 ore. Utilizzare una reazione di 40 ml contenente 2 mg di PXL, 4 pl di 10x NEB Buffer 2, 1 ml di acqua e BBS1 equilibrio. Sottoporre il digerito-PXL alla purificazione del gel di routine utilizzando un kit commerciale. Assicurarsi che la resa è ~ 8,5 kB prodotto. Utilizzando un kit di legatura commerciale, legare 1 ml di 1: 1.000ricotto-oligo con 50 ng di digerito e gel purificato-PXL. Trasformare il prodotto legatura in ricombinazione competente carente E. coli (NEB 5-alfa, efficienza subcloning). Schermo trasformanti per la presenza della guida corretta mediante sequenziamento di DNA plasmidico. Digest U6, guida filo, e gli elementi di RNA impalcatura (sgRNA) di PXL utilizzando BstB1 e PAC1 enzimi di restrizione e legare in fluorescente dorsale virale proteina-T2A-Cas9 digerito con gli stessi enzimi di restrizione. Trasformare il prodotto legatura (NEB 5-alfa massima efficienza). Le fluorescenti proteina-T2A-Cas9 plasmidi backbone virale sono bassi plasmidi di copia e protocolli in tal modo low copy devono essere utilizzati. NOTA: Una seconda sgRNA può essere simile introdotto da Paci digestione di un altro PXL guida filone plasmide e ligato nel PAC1 digerito e fosfatasi vitello-intestinale trattata dorsale virale che contiene già il primo filone guida. trattamento fosfatasi del plasmide trasferimento virale aiuteràridurre il numero di trasformanti dalla auto-legatura di plasmidi che non contengono la seconda guida. Sequenza verificare il plasmide e maxi finale di preparazione utilizzando il kit di preparazione maxi Nucleobond Xtra e confezionarlo in un virus utilizzando il "Protocollo per il Retro / lentivirali Produzione – Metodo CaPO4" in seguito. 2. Preparare 293FT / 293GP cellule per trasfezione (Retro / lentivirali Produzione – Metodo CaPO4) (1 ° giorno) Rapidamente scongelare 1 flacone di cellule per 10 centimetri piastra di coltura cellulare in un bagno d'acqua a 37 ° C. Per il confezionamento lentiviral, usare 293FT cellule. Per il confezionamento retrovirale, utilizzare 293GP (gag / pol) cellule. Pipettare tutte le cellule scongelate dal tubo crio in un tubo da 15 ml e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato CO 2 equilibrata completamento Modified Media Dulbecco di Iscove. celle di centrifugazione per 5 min a 500 xg a pellet. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di completo èbaia di Modified Media Dulbecco. Piastra le cellule su un 10 centimetri piatto di coltura cellulare. Incubare le cellule notte a 37 ° C in un incubatore anidride carbonica 5%. (Day 2) 24 ore dopo la placcatura, cambiate multimediale su piastra aspirando media esistenti e aggiungendo 10 ml di pre-riscaldato Piano di Iscove Modified Dulbecco alla piastra. (Giorno 3-4) 24-48 ore dopo la modifica di supporto e una volta che le cellule diventano confluenti, dividere le cellule ad una confluenza di 2,5-3,0 x 10 6 cellule / piastra (10 cm Piatto). Per dividere le celle, aspirare media e lavare la piastra con 5 ml di PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina alla piastra e incubare a 37 ° C finché le cellule sollevare la piastra. Aggiungere 0,5 ml di mezzo di Iscove Modified Dulbecco per neutralizzare la reazione tripsina 0,25% e pipettare le cellule in una provetta da 1,5 ml. Spin le cellule a 500 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di Modified medio Dulbecco Iscove. Diluire 1081; l di cellule in 90 ml di PBS. Contare le cellule utilizzando sia un emocitometro o contatore di cellule automatizzato. Re-piatto 2,5-3,0 x 10 6 cellule / piastra con Modified Media Dulbecco completo di Iscove. NOTA: Le cellule saranno ~ 50% confluenti 24-34 ore dopo la placcatura. Trasfezione le cellule quando sono ~ 50% confluenti. 3. (5 ° giorno) CaPO4 Transfection e Viral Collection particelle Modificare l'ora dei media 2 prima di trasfezione aspirando i mezzi di comunicazione esistenti e l'aggiunta di 10 ml di pre-riscaldato Modified Media Dulbecco di Iscove. Assicurarsi che vi sia esattamente 10 ml di media nella piastra 10 cm. Preparare i reagenti di trasfezione per 2 piatti a base di tubi in polistirolo fondo rotondo 2, 5 ml. Etichettare il primo tubo "DNA" e il secondo tubo "2X HBS". Regolare la concentrazione di DNA a 1 ug / ml in tampone Tris-EDTA a pH 7,4. Per lentivirus, aggiungere lentamente 20 ml di vettore di trasferimento (The Viral costrutto di interesse), 13 ml di CMVdelta8.9, 9 ml di VSV-g, 860 ml di biologia molecolare di grado H 2 O, e 100 ml di 2,5 M CaCl 2 al primo tubo ( "DNA"), mentre continua autofilettanti sul tubo per mescolare. Per i retrovirus, omettere il plasmide CMVdelta8.9. Aggiungere 20 ml di trasferimento vettore, 15 ml VSV-g, 860 ml Molecular Biology Grade H 2 O, e 100 ml 2,5 M CaCl 2 alla provetta con l'etichetta "DNA". Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica 2x HEPES-buffered (pH 7.0; questo pH è assolutamente fondamentale) alla provetta con l'etichetta "2X HBS". Aggiungere lentamente il contenuto 1 ml del tubo "DNA" al tubo "2X HBS", una goccia alla volta. Continuamente toccare il tubo "2X HBS" con il dito indice o medio, mentre l'aggiunta del contenuto del tubo "DNA". Osservare apparenti Capo 4 vescicole dopo ogni caduta. Incubare la provetta al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di trasfezione in goccioline lenti a ciascuna piastra cella 10 cm incubare una notte a 37 ° C. (Giorno 6) Sostituire media con 8 ml di Modified Medium + 0,5% FBS Dulbecco di Iscove e 100 ml dei media 40 mg di caffeina /. Se il vettore di trasferimento contiene un marcatore fluorescente, quindi espressione fluoroforo indica una trasfezione di successo. (7 ° giorno) Raccogliere il supporto contenente le particelle virali utilizzando un 10 ml pipetta sierologica ed erogare in un tubo conico da 50 ml. Conservare il tubo conico da 50 ml a 4 ° C. Aggiungere 8 ml di 0.5% Mezzi di FBS per ogni piatto. (Giorno 8) Anche in questo caso, raccogliere i supporti contenenti le particelle virali e si combinano con la raccolta del giorno precedente nel tubo conico da 50 ml. 4. concentrazione e purificazione del virus Fare un 5x polietilene glicole 6000 con l'aggiunta del 40% di polietilene glicole 6000 e 1,5 M di NaCl per DDH 2 O. Autoclave la soluzione suil ciclo di liquido per 45 min a 121 ° C. Lentamente mescolare la soluzione durante il raffreddamento. NOTA: La soluzione inizierà nuvoloso e poi diventato chiaro come si raffredda. Centrifugare la provetta conica da 50 ml contenente entrambe le collezioni del surnatante virale a 2.000 xg per 10 min per pellet materiale insolubile. Purificare la media virali filtrando attraverso un filtro da 0,45 micron a basso contenuto proteico siringa legame (PES o PVDF). Aggiungere 5x polietilene glicole 6000 soluzione ai media (La concentrazione finale dovrebbe essere l'8% di polietilene glicole 6000 e 0,3 M NaCl). Miscelare invertendo i tubi diverse volte (non vortex). Incubare la soluzione di polietilenglicole virale contenente a 4 ° C per 12 o più ore, rimescolando di tanto in tanto. (Giorno 9) Centrifugare la soluzione contenente glicole polietilenico virale a 2.500 g per 45 min. Rimuovere e scartare il surnatante e far girare ancora per 2 minuti. Anche in questo caso, rimuovere ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet aggiungendo 320 ml disterile PBS (320 ml è 1/100 del volume originale di supporti contenenti virali raccolti) e incubare una notte a 4 ° C. Facoltativamente, risospendere il pellet a temperatura ambiente su un agitatore meccanico per 30 min. Dopo ri-sospensione il pellet, un'aliquota del virus (5-10 ml per 0,5 ml tubo) e congelare aliquote a -80 ° C (congelamento scongelamento o conservazione a 4 ° C ridurrà drasticamente il titolo). Titolo i virus utilizzando protocolli standard, vale a dire, eseguire una serie di diluizioni su un 6-pozzetti di cellule HEK293T e contare manualmente colonie fluorescenti 48 ore più tardi. 5. prove di efficacia del virus CRISPR NOTA: i cloni sequenza usando le seguenti operazioni per testare per la produzione di rotture del doppio filamento riparati da NHEJ utilizzando le cellule del mouse Neuro2A. Questo ha il vantaggio rispetto saggi geometra in quanto può essere utilizzato per determinare la percentuale di cellule che sono stati modificati e la naturadei indels derivanti da NHEJ. Coat un piatto di coltura cellulare 3,5 centimetri con una miscela proteica gelatinosa come matrigel diluito 1:50 in Modified medio Dulbecco Iscove e incubare per 30 min a 37 ° C. Aspirare la miscela proteica gelatinosa e piastra le cellule Neuro2A. Dopo che le cellule Neuro2A raggiungono il 50% di confluenza, aggiungere il CRISPR Lentivirus o Retrovirus ad una molteplicità di infezione di 10 (cioè, 10 particelle virali per cella). NOTA: le cellule Neuro2A non sono così amabile alle infezioni come lo sono HEK293 cellule, in tal modo, una singola infezione si traduce in 100% delle cellule che sono infettate con il lentivirus. Inoltre, il retrovirus infetta solo le cellule in divisione e quindi inoltre non provocare infezioni 100%. Al fine di raggiungere un tasso vicino al 100% di infezione, aggiunta di virus può essere ripetuta più giorni, dividendo le cellule come necessario. In alternativa, le cellule positive fluorescenti possono essere isolate utilizzando la fluorescenza-attivato cell-smistamento. the modo più efficace per raggiungere un tasso di infezione del 100% con un lentivirus è quello di eseguire una singola infezione seguita da isolamento FACS. Per un retrovirus, eseguire 4-cicli di infezione 24 ore a parte e seguire per l'isolamento FACS per garantire% di infezione 100. Dopo infettare le cellule per 1 settimana, espandere le cellule a confluenza vicino su una piastra 10 cm aspirare i media, e lavare la piastra con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C finché le cellule sollevare la piastra. Aggiungere 0,5 ml di mezzo di Iscove Modified Dulbecco per neutralizzare la reazione tripsina 0,25% e pipettare le cellule in una provetta da 1,5 ml e agglomerare le cellule a 500 xg per 5 min. Per isolare DNA, aggiungere 100 ml di 50 mM di idrossido di potassio, risospendere le cellule, e incubare a 95 ° C per 5 min. Neutralizzare la soluzione con 10 ml di 1 M Tris, pH = 8,0. PCR amplifica la regione che fiancheggia la regione genomica di destinazione del CRISPR sgRNAutilizzando ~ 300 ng del DNA isolato in fase 5.5 utilizzando un alta fedeltà PCR Master Mix 4. Eseguire la reazione di PCR su un gel di agarosio 2,5% e gel purificare il frammento di dimensioni appropriate utilizzando un kit di purificazione gel come un kit gel recupero DNA. Legare in un vettore di clonaggio PCR come pGEM-t-facile e trasformarsi in cellule competenti 9. 24 ore più tardi, aggiungere 2 ml di brodo LB in un 15 ml a fondo rotondo tubi nonché l'antibiotico appropriato (ampicillina, neomicina, etc.). Inoculare il tubo con una colonia singola utilizzando una punta di pipetta sterile o loop per selezionare una singola colonia dalla LB-plate. Espandere e far crescere la colonia agitando la provetta a 250 RPM e 37 ° C per 24 ore. Ripetere l'operazione per il maggior numero di colonie, se lo desideri. Utilizzo di un mini-prep kit, isolare il DNA da E. coli e sequenza con primer disegnati per amplificare la regione del gene bersaglio dal sgRNA per analizzare la regione Cas9 mirata del genoma del topo. 6. Stereotassica iniezione protocollo per il topo adulto Preparare per la chirurgia NOTA: E 'importante mantenere condizioni di sterilità durante interventi chirurgici di sopravvivenza. Ciò si ottiene in questo protocollo dal calore sterilizzare gli strumenti chirurgici, utilizzando betadine per sterilizzare il sito di iniezione, e l'aggiunta di pomata antibiotica al sito di incisione dopo averlo chiuso. E 'anche importante usare guanti sterili nonché un accuratamente sterilizzato, zona chirurgia dedicata. Sterilizzare calore strumenti di chirurgia prima dell'uso da una autoclave o mediante sterilizzatore a caldo tallone. Preparare camera di recupero e zona chirurgia accendendo termofori per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico e il recupero. Montare il trapano usato per creare fori nel cranio iniettabile. Carico 4 ml di virus in ago per l'iniezione di ritirare il virus direttamente dalla provetta sterile PCR. Brevemente rimuovere l'aliquota virale da ghiaccio. Mantenere il virusnella siringa a temperatura ambiente per non più di 1 ora prima dell'iniezione. 7. Iniezione Stereotassica Verificare che la ventilazione per la suite di chirurgia è aperto per garantire il corretto flusso d'aria. Preparare il mouse per un intervento chirurgico per anestetizzare con il 4% isoflurano in una camera di induzione. Dopo l'anestesia, la barba la testa per preparare il sito di iniezione. Posizionare il mouse nello strumento stereotassico utilizzando pinzette per spostare la lingua verso il basso e di lato. Inserire la barra morso in bocca fino a quando i denti cadono nella fessura, quindi fissare le barre orecchio. Assicurarsi che il corpo del mouse è sulla rampa di riscaldamento e il naso si trova nel cono. Diretto 4% isoflurano nel cono naso. Confermare l'anestesia da pizzicare il piede con una pinzetta e garantire che non vi è alcun riflesso di trasalimento. Applicare lacrime artificiali per lubrificare gli occhi. Fine preparazione del sito di iniezione tamponando la testa rasata con alternanza di cicli di povIdone-iodio e lidocaina. Usando un bisturi, tagliare piccola incisione lungo il centro del cuoio capelluto. Asciugare il cranio con un perossido di idrogeno tampone e, se necessario, per aiutare a visualizzare bregma. Utilizzando un ambito dissezione, individuare bregma sul cranio e posizionare la punta trapano su bregma. Zero (o registrare) le coordinate stereotassica digitali sui piani x, ye z. Al fine di garantire che la testa sia in piano sul rostrale a caudale asse y, posizionare la punta su lambda e livellare la testa in modo che la coordinata z è approssimativamente uguale sia bregma e lambda. Al fine di garantire che la testa sia in piano sul l'asse x, posizionare la punta a y = 1/2 lambda. Assicurarsi che la coordinata z è uguale a 1 mm per lato (x = +/- 1 mm) della sutura sagittale. Regolare il cranio se vi è una differenza nel coordinata z a 1mm a sinistra ea destra di lambda. Posizionare il trapano sopra le coordinate desiderate. Per il giro dentato, utilizzare la coordinatasy = -1.9 dal bregma e x = +/- 1,1. Prima di forare, abbassare il isoflurano al 2%, poi lentamente e con attenzione, forare il cranio. Dopo aver praticato tutti i fori, apporre il pieno siringa sullo strumento stereotassico. Visivamente centrare la siringa sopra il foro e zero coordinata z il cranio. Abbassare lentamente la siringa a più profonda Z-profondità. Per il giro dentato, gli z fondali sono -2.5, -2.4, e -2.3. Iniziare iniezione ad una velocità di 0,25 ml / min usando un iniettore stereotassico. Dopo l'iniezione è completo a basso Z-profondità, attendere 1 minuto, quindi sollevare al prossimo coordinare e ricominciare iniezione. Continuare questo modello fino a quando tutte le coordinate Z-iniezione vengono iniettate. Attendere 2 minuti prima di rimuovere la siringa dopo l'ultima iniezione. NOTA: Nessun effetto negativo sono stati notati sul tessuto iniettando fino a 2 ml di virus per dell'emisfero nel cervello di topo. iniezione Ripetere l'operazione per gli altri fori. Dopo l'iniezione, rimuovere il mouse dallo strumento stereotassico e suturare il cuoio capelluto con 6-0 punti di sutura in seta. Applicare lidocaina e una crema antibatterica alla ferita. Iniettare 0,8-1,0 ml di soluzione fisiologica + Ketoprofene (3-5 mg / kg) per via IP per gestire il dolore. Poi posto del mouse nella camera di recupero riscaldato. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non rispedire l'animale verso la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. Nei giorni dopo l'intervento, pesare il mouse quotidiana e fornire cibo morbido e tratta. Controllare ferita e notare la generale condizione di / contegno. Dopo l'iniezione stereotassica, i topi possono essere eutanasia per fetta preparazione elettrofisiologia 1 o perfuso e il loro cervello rimosso, affettato, e macchiato tramite immunoistochimica per l'analisi 10.