Consecuencia del epicardio y Ensayo de Cultivo<em> Ex Vivo</em> Evaluación de la migración de células derivadas del epicardio
概要
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Una sola capa de líneas de células epicárdicas el corazón, proporcionando factores paracrinos que estimulan la proliferación de los cardiomiocitos y contribuir directamente progenitores cardiovasculares durante el desarrollo y la enfermedad. Mientras que un número de factores han sido implicados en la movilización de células derivadas del epicardio (CDEP), los mecanismos que regulan su posterior migración y diferenciación son poco conocidos. A continuación, presentamos in vitro y ex vivo para estudiar las estrategias de EPDC la motilidad y la diferenciación. En primer lugar, se describe un método para obtener células epicárdicas primarias por la cultura consecuencia del corazón de embriones de ratón. También presentamos un protocolo detallado para evaluar la migración tridimensional de EPDC marcado en un sistema de cultivo de órganos. Ofrecemos pruebas de que el uso de estas técnicas de eliminación genética de miocardina relacionados con factores de transcripción en el epicardio atenúa la migración EPDC. Este enfoque sirve como una plataforma para evaluar modificadores candidatos de EPDCbiología y podría ser utilizado para desarrollar pantallas genéticos o químicos para identificar nuevos reguladores de movilización EPDC que podrían ser útiles para la reparación cardiaca.
Introduction
El epicardio es una sola capa de células mesoteliales que recubre el corazón y los impactos cardiaca desarrollo, maduración y reparación. A través de un intercambio muy coordinada de señales paracrinas, el diálogo íntimo entre el miocardio y epicardio es indispensable para el crecimiento cardíaco y la formación de no miocitos cardíacos linajes 1. Células epicárdicas derivados (CDEP) emergen de un subconjunto de células epicárdicas a través de un epitelio-a-mesenquimal transición (EMT) 2, invadir el espacio subepicárdica y el miocardio subyacente, y diferenciar en gran medida en las células murales vasculares coronarias y fibroblastos cardíacos, y a una en menor medida, las células endoteliales y cardiomiocitos 3-9.
Los mecanismos que regulan la EMT epicárdico y la invasión EPDC se han atribuido a la acción coordinada de diversas moléculas, incluyendo ligandos secretados 10-13, receptores de superficie celular y moléculas de adhesión, 14,15 regudores de la polaridad apical-basal 16,17, 18,19 pequeñas GTPasas, y factores de transcripción 2,20,21. Mientras que muchos de los efectores moleculares de la migración EPDC se han definido, una mejor comprensión de las señales fisiológicas que estimulan la movilización EPDC en el embrión puede acelerar el desarrollo de estrategias para manipular este proceso en el adulto para mejorar la reparación cardíaca.
Estudios dirigidos a la identificación de nuevos reguladores de movilización EPDC se basan en la purificación de esta población de células o trazando la migración de las células epicárdicas individuales. Uno o una combinación de genes marcadores, incluyendo WT1 Tcf21, Tbx18, y / o Aldh1a2, se utiliza comúnmente para identificar el epicardio fetal al 1. Sin embargo, el uso de estos marcadores para realizar un seguimiento migrando EPDC no es óptima como expresión de marcadores epicárdicas disminuye en el transcurso de desarrollo del corazón y, a menudo se pierde cuando las células epicárdicas someten transdifdife- en las células mesenquimales.
La aplicación del sistema Cre / loxP, en conjunción con la prensa de linaje de trazado, ha sido útil en el etiquetado de forma permanente el epicardio y sus descendientes durante el desarrollo del corazón y después de una lesión isquémica en el adulto 7,22,23. Varias líneas de Cre epicárdicas restringida se han generado y se utilizan ampliamente para etiquetar EPDC y para las estrategias de deleción de genes condicional 1. Estos estudios han llevado a la caracterización de diversos linajes epicárdicas, y la identificación de mediadores críticos de EPDC la motilidad y la diferenciación. Sin embargo, la acumulación de evidencia también sugiere el epicardio es una población heterogénea de células progenitoras 4,24,25. Por lo tanto, sólo un subconjunto de las células epicárdicas se orientará con un controlador de Cre dado.
Con el fin de etiquetar todo el epicardio independientemente de Cre especificidad, un número de laboratorios han utilizado cul excrecenciasistemas tura o ex vivo los métodos de cultivo de órganos para aislar fielmente o marcar las células epicárdicas sin depender de la expresión de un linaje genético marcadores 26-28. Para los estudios ex vivo de migración, corazones embrionarias son aislados antes de la EMT epicárdica y se cultivaron en medio suplementado con una proteína fluorescente verde (GFP) expresando adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Este enfoque permite el etiquetado eficiente de toda el epicardio en vez de un subconjunto de células por recombinación mediada por Cre. Culturas corazón son posteriormente expuestos a inductores conocidos de EMT para estimular la movilización de EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo análisis se complementan con in vitro cultivos de explantes epicárdicas, que son un enfoque particularmente útil para explorar mecanismos detallados que impulsan la migración EPDC.
A continuación, se describen los métodos para aislar células epicárdicas primarios para los estudios in vitro de epicardial EMT, así como un sistema de cultivo de órganos ex vivo para los análisis de EPDC motilidad. Recientemente hemos demostrado la utilidad y robustez de este método mediante la modulación genéticamente relacionados con el factor de transcripción miocardina-(MRTF) / factor de respuesta a suero (SRF), el eje de señalización para manipular la migración basada en la actina de EPDC 9. Aunque nuestros resultados ponen de relieve una vía de señalización necesaria para la regulación de la migración EPDC, estos métodos son adecuados para desentrañar los mecanismos que organizan conjuntamente la migración y diferenciación de EPDC. Por otra parte, el explante y ex sistemas de cultivo in vivo podrían ser implementadas en las pantallas funcionales para identificar nuevos reguladores de la movilización de EPDC para aplicaciones terapéuticas en la regeneración cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación describimos los métodos detallados para aislar células del epicardio primaria por derivación y seguimiento de la migración de EPDC en cultivos ex vivo del corazón. Para los cultivos de excrecencia, el momento adecuado para retirar el corazón epicardio-agotado varía ligeramente entre los experimentos. Se recomienda la monitorización periódica de los explantes después de una noche de incubación para medir el grado de derivación epicárdica y extraer el corazón antes de que aparezcan l…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) [número de concesión R01HL120919]; el [número de concesión 10SDG4350046] Asociación Americana del Corazón; Universidad de Rochester premio CTSA del NIH [número de concesión UL1 TR000042]; y los fondos de arranque en el Aab CVRI. MAT fue apoyado en parte por una subvención a la Universidad de Rochester Facultad de Medicina y Odontología de la Med-En-Grad Iniciativa Instituto Médico Howard Hughes; y un Premio al Servicio Nacional de Investigación Institucional Ruth L. Kirschstein de los NIH [número de concesión GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
参考文献
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
