Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em> Caenorhabditis elegans</em

Per quasi 50 anni nematode Caenorhabditis elegans si è affermata come un potente modello per studiare le questioni importanti in fase di sviluppo, neurobiologia, l'evoluzione, interazioni ospite-patogeno, ecc ¹ Il punto di forza di questo modello per lo studio dello sviluppo risiede nella: suo ciclo di vita breve di 3 giorni; la facilità con cui questi animali possono essere geneticamente modificate; la trasparenza che permette l'osservazione di spostamento e la morfologia cellulare in animali viventi e il suo sviluppo che è prevalentemente extra-uterina. Le fasi di sviluppo del nematode coinvolgono embriogenesi e quattro stadi larvali (da L1 a L4), seguito da adulta. Durante lo sviluppo embrionale, epidermica morfogenesi attirato considerevole attenzione per la sua capacità di consentire una migliore comprensione di come epiteliali cellule migrano come gruppo, come si riorganizzano loro giunzioni e modificare la loro morfologia individuale così come il posizionamento corrispondenti entro un epitelio funzionale.Epidermal morfogenesi è diviso in quattro fasi: intercalazione dorsale che consiste nella riorganizzazione delle cellule epidermiche dorsale, indicato come l'ipoderma; recinzione ventrale, che consiste nella migrazione delle cellule ipodermici ventrale verso la linea mediana ventrale incassa quindi l'embrione in un monostrato di cellule epiteliali; all'inizio e alla fine l'allungamento trasformare l'embrione a forma di fagiolo in larve vermiforme. A seguito di morfogenesi, portello di embrione e L1 larve iniziano a nutrire utilizzando batteri disponibili nel loro ambiente immediato.

allungamento embrionale è quindi una fase tardiva dello sviluppo embrionale. Consiste dell'estensione dell'embrione lungo il suo asse longitudinale ed una riduzione del suo diametro trasversale. Ciò comporta una modificazione drammatica della forma delle cellule ipodermici. Allungamento è diviso in una prima e una fase tardiva. La prima fase inizia nella fase virgola e si conclude quando i muscoli del corpo a parete iniziano a contrarre in fase di 1,75 volte in wILD-type (WT) embrioni – corrispondente a embrioni che sono 1,75 volte di lunghezza rispetto agli embrioni non allungata. Processi morfogenetici che si verificano in quella fase sono trainate principalmente dalla contrazione dei fasci filamentosi di actina (FB) situati al polo apicale delle cellule ipodermici che guidano il loro allungamento lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione ^2. Contrazione di FB è il controllo da fosforilazione delle catene della miosina-luce da tre chinasi LET-502 / rock, MRCK-1 e PAK-1 ^5. La fase tardiva del allungamento, inizia quando i muscoli del corpo a parete diventano funzionali e iniziare amministrazione. Si tratta di segnalazione meccanotrasduzione dai muscoli del corpo a parete alle cellule dorsali e ventrali ipodermici e termina quando gli animali si schiudono ^3.

difetti di allungamento sono generalmente caratterizzati dalla percentuale di animali che muoiono come embrioni (letalità embrionale, Emb) e quelli arrestare il loro sviluppo come larve L1 (larvale fenotipo arresto; Lva) e di essere significativamente più breve di peso. L'identificazione della fase di arresto dello sviluppo richiede osservazione al microscopio di embrioni morti e arrestato larve ^3-6.

E 'stato recentemente dimostrato che diversi geni, come ad esempio il / regolatore di Cdc42 Rac e effettori pix-1 e pak-1, il controllo dei processi morfogenetici sia in fase precoce e tardiva di allungamento ^3,7. Abbiamo anche recentemente dimostrato che i processi morfogenetici differiscono lungo l'asse antero-posteriore degli embrioni durante la prima allungamento ^{3 7.} Questi risultati motivato lo sviluppo di nuove metriche rivolte specificamente alle fasi di allungamento presto o tardi e altri parametri che consentono la caratterizzazione della morfologia degli embrioni lungo il loro asse antero-posteriore durante l'allungamento presto.

Questi nuovi metodi consistono nel misurare la lunghezza di embrioni all'inizio e alla fine dell'allungamento precoce e la larghezza della loro luiannunci e le code. ⁷ due protocolli sono stati sviluppati anche per misurare la lunghezza delle larve appena schiusi, sincronizzati in fase L1 ^7.

I gusci di uova di embrioni li proteggono trattamento ipoclorito alcalino mentre larve, adulti e batteri presenti nei mezzi di coltura vengono sciolti dal trattamento. Questo trattamento viene poi utilizzato per purificare embrioni da una popolazione non sincronizzato contenente una maggioranza degli adulti ben nutriti ^8. restrizione alimentare viene utilizzato per sincronizzare le larve neonate. Misurare la lunghezza di queste larve viene quindi utilizzato per rilevare difetti di allungamento. Questa misurazione è preferibile rispetto alla misura di larve catturato su piastre di coltura a causa larve che si schiudono da non interamente embrioni allungati può recuperare a "lunghezza normale" durante l'alimentazione ma mantenere la loro ridotta dimensione quando arrestato in assenza di cibo.

Qui, presentiamo protocolli dettagliati che consentono la misurazione del length di allungamento embrioni così come la larghezza della loro testa e la coda utilizzando time-lapse DIC microscopia e analisi di immagine (protocollo 1). Forniamo anche protocolli dettagliati per misurare la lunghezza delle larve sincronizzata utilizzando l'analisi dell'immagine (protocollo 2) e citometria a flusso (protocollo 3).