Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos<em> In-Vitro</em> isquemia
概要
Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). Aquí, estamos reportando un método práctico de protocolo de cultivo de astrocitos del hipocampo sexado con el fin de estudiar los mecanismos que subyacen a la función de los astrocitos en cachorros recién nacidos masculinos y femeninos después de la isquemia in vitro.
Abstract
Astrogliosis siguiente / isquemia (HI) -relacionado lesión cerebral por hipoxia juega un papel en el aumento de la morbilidad y la mortalidad en los recién nacidos. Los estudios clínicos recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo, y que los recién nacidos varones son más susceptibles a los efectos de la lesión cerebral relacionada con HI, dando lugar a resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables. El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones altamente enriquecidas de los astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. En este estudio, se describe un método para crear cultivos de astrocitos de hipocampo específicos del sexo que están sometidos a un modelo de isquemia in vitro, la privación de glucosa en oxígeno, seguido por la reoxigenación. astrogliosis reactiva subsiguiente fue examinado por immunostaiNing para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y S100B. Este método proporciona una herramienta útil para estudiar el papel de los astrocitos del hipocampo masculinos y femeninos siguiente neonatal HI, por separado.
Introduction
Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). La creciente cuerpo de evidencia indica que las funciones de los astrocitos son más que proporcionar apoyo neuronal. De hecho, las funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas pueden ser muy complejos, como guía la migración de los axones jp desarrollo 1, la regulación de CNS flujo de sangre 2, el mantenimiento de la homeostasis del pH del fluido intersticial sináptica 3, y participar en la barrera hematoencefálica 4 y 5 la transmisión sináptica. En condiciones patológicas, los astrocitos responden a la lesión con un proceso llamado astrogliosis reactiva en la que la morfología, el número, la ubicación, la topografía (con respecto a la distancia de insulto) y la función de los astrocitos pueden cambiar de una manera heterogénea 6,7. Astrogliosis visto después de la encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal puede que contribuye a la morbilidad y la mortalidad de los recién nacidos <shasta> 8.
estudios clínicos y experimentales recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo y que los recién nacidos masculinos son más susceptibles a los efectos de la hipoxia / isquemia (HI) lesión cerebral -related, resultando en resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables 9-11. Aunque la localización de la lesión depende de la edad gestacional y la duración y la gravedad de la lesión, el hipocampo es una de las regiones más comúnmente realizada en el SNC después neonatal HI plazo, y astrogliosis hipocampo ha sido confirmado por la sobre regulación de aumento la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d después de la HI neonatal 7,10,12,13. Las diferencias de sexo en función de los astrocitos se muestran en ambos neonatos y roedores adultos después de la isquemia cerebral 14,15. Además, la susceptibilidad astrocytic macho a la isquemia in vitro se demostró por el aumento de cell muerte en comparación con los astrocitos corticales femeninas en la cultura 16.
Las diferencias de sexo comienzan en el útero y continúan hasta la muerte 17. Durante la última década, la importancia de incluir los sexos en condiciones experimentales en cultivo celular y estudios in vivo han sido el énfasis del Instituto de Medicina y los NIH para buscar el conocimiento fundamental de las diferencias sexuales observadas en condiciones fisiológicas y patológicas 17,18 . El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones de astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. El presente estudio fue diseñado para proporcionar las técnicas para preparar cultivos de astrocitos del hipocampo sexo-específicas enriquecidas a partir de ratones recién nacidos con el fin de evaluar el papel de los astrocitos GFAP-inmunorreactivas siguientes oxígeno / glucosa Privación (OGD) y reoxigenación (Reox), induciendoHI en el ambiente de cultivo celular. Esta técnica se puede utilizar para probar cualquier hipótesis relativa a los astrocitos del hipocampo en los machos y hembras neonatales en condiciones de normoxia e isquémicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de estudiar las diferencias de sexo en las propiedades y funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas y patológicas, la preparación de los astrocitos primarios sexado en cultivo celular es una herramienta importante que se utilice. En el presente estudio se presenta un altamente eficiente y un método reproducible a la cultura de una población homogénea altamente enriquecido de los astrocitos del hipocampo sexado de recién nacido (P0-P2) C57Bl / 6 (de tipo salvaje) o K19F (GFAP nulo) crías d…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| その他 | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
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