הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר
概要
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
חילופי חומרים מזינים, גזים וחומרי פסולת במהלך הריון eutherian מתווך על ידי השליה. במערכת הרבייה הנשית, עורקי הרחם הם הצינורות העיקריים של דם אל הרחם. לאחר השתלה, סניף אלה לתוך כלי מיוחד הנקרא עורקי ספירלה שסליל דרך basalis decidua ליחידת fetoplacental. קוטר ואלסטיות של עורקי ספירלה אלה, אשר מוקפים בלויקוציטים, בתאים מסוימים רוצח טבעי רחם (אונק), להכתיב נפח ומהירות של דם זמין ל1,2 השליה. שינויים המודינמית נכונים כתוצאה משיפוץ של עורקי הספירלה הם קריטיים להצלחת הריון.
בעוד המנגנונים שונים בפירוט בין אדם והריון עכברי, התוצאה הסופית של תהליך שיפוץ בשני המינים הוא כלי דם מורחבים, גבוה מוליכות שמאבדים את שכבת שריר החלק שלה. בעכברים, אונק תא הנגזר אינטרפרון (IFγ N-) הוא הכרחי כדי לגרום לשינויים אלה בסביבות אמצע ההריון-3-5. עכברים שחסרים או תאים או רכיבים של מסלול איתות IFN-γ NK לא מצליחים לעבור שינויים אלה וזה קשור ל6,7 גדילת העובר מופחת, והדגיש את החשיבות של אספקת דם הולמת ליחידת fetoplacental. במהלך ההריון אנושי מוקדם, פלישת ביניים וendovascular של trophoblast extravillous והאינטראקציה שלהם עם תאים אונק חשובות לגרימת שינויים בכלי הדם וקידום 8-10 גדילת העובר. תאים אונק יכולים לתזמר פלישת trophoblast אדם באמצעות כמוקינים 11 וציטוקינים כגון מקרופאג granulocyte – גורם המושבה גירוי (GM-CSF) 12. פלישת trophoblast רדודה קשורה לסיבוכי שיפוץ עורקים והריון מופחתים כגון רעלת הריון 9.
פרוטוקול זה מבוסס על עבודתו החלוצית של אנה Croy שתאר חשובתפקידה של מערכת החיסון וIFN-γ במיוחד נגזר NK לשיפוץ מוצלח של כלי דם באמצעות ניסויי אימונוהיסטוכימיה והעברה אלגנטית 5,13. כאן אנו מתארים את דרך מהירה וחסכונית כדי להעריך את מצב שיפוץ של עורקי ספירלה. למרות שהמעבדה שלנו מעריכה באופן שגרתי הזה באמצע ההריון (יום הריון (ה ') 9.5) 14, תהליך שיפוץ מתקיים בין gd8.5 ו12.5 15. כניסתו של סורקי שקופיות אוטומטיים יש להקל באופן משמעותי את ההערכה של אזורי כלי ולומן מסעיפים ומצאנו את זה כדי להיות גישה לשחזור יותר מאשר מדידת קטרי כלי. התוספת של זיהוי immunohistochemical של SMA מאפשרת לאימות ישירה של התוצאות שהתקבלו מהערכת stereological. כמו בכל טכניקות stereological, מומלץ לבצע ההערכה כניסוי מסונוור לפחות שני בוחנים. לשם כך, ניתן הציג צעד אקראי כאשר סדרתי לחתוךטינג הדגימות כך שהחוקרים להעריך את השקופיות לא יודעים שמקבוצת ניסוי הדגימות לבוא.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק כלי אמין כדי להעריך בזהירות את שיפוץ של עורקים סליליים בעכברים עם גנוטיפים אימהיים ואבהיים מוגדרים, בהקשר של מודלים עכבר לסיבוכים הקשורים להריון. התוצאות מדגישות את התלות בתאים אונק של תהליך זה, שהוא חיוני לצמיחה תקינה של העובר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן נועד לספק שיטה לשחזור הקשורים ליישום שינויים בכלי הדם הנדרשים להריון מוצלח. קריטי להצלחה של הערכה זו היא האיכות של חלקי רקמות. שניהם קביעה מדויקת של גיל הריון אתרי השתלה וכן באופן מהימן ligating עורקי הרחם הם צעדים חיוניים. שינויים בפרמטרים כגון זמן של קיבעון, פרוטוקול עיבוד רקמות, וכו 'עשויים להשפיע גם על התוצאה. להערכה stereological משוחדת, חשוב למדוד את אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. מומלץ למדוד 5 כלי לאתר השתלה וכל אתר השתלה בשלושה עותקים. הממוצע של 15 מדידות אלה מייצג את הגודל הממוצע של 5 כלי הגדולים ביותר.
בהמשך לנתונים מRag2 alymphoid – / – IL2rg – / – עכברים שמוצגים כאן, מצאנו prot זהocol שימושי עבור מספר הדגמים של תפקוד מערכת חיסון אימהי לקוי, כולל אחד מתאי NK עכבות 14. פגמים בשיפוץ עורקים גם הוכחו במודלים של פלישת trophoblast לקוי 18 והטכניקות המתוארות כאן עשויות להיות מועילות כדי להעריך את כלי הדם במקרים אלה. אנו מותאמים ומאומתים פרוטוקול זה לחקירת שיפוץ כלי דם decidual באמצע ההריון בעכבר, אבל זה גם מתקבל על הדעת להתאים פרוטוקול זה לעבוד במערכות אחרות מודל (למשל חולדות) או אפילו באיברים אחרים. בעוד אנו מוצאים כי שיפוץ NK-תלוי ניתן להעריך חסונה בgd9.5, זה יכול להיות מתוקן לנקודות זמן אחרות כגון gd12.5, כאשר כלי הדם האימהיים הוא שופץ לחלוטין. בנקודה זו בזמן, פלישת trophoblast endovascular היא עמוקה יותר 16 ונקודת זמן זו עשויה להיות מתאימה יותר לחקירות של התפקיד trophoblast לשינויים בכלי הדם. אם קריאות כמותית נוספות רצויים,חוקרים יכולים גם להגדיל את מספר הסעיפים המוכתמים עבור SMA ולהעריך את אחוז כלי שופצו באופן חלקי בכל אתר השתלה.
הגבלה של פרוטוקול זה היא תיאורי הטבע של בדיקות היסטולוגית. מבחני פונקציונליים, לעומת זאת, הם רק הופכים לאט זמינים (כגון אולטרסאונד דופלר 19). טכניקות אלה דורשות מומחיות טכנית והוצאות גבוהות בהרבה לרכישה ותחזוקה של ציוד, אבל יש את היתרון של מתן אורך קריאת נתוני vivo להשפעת השינויים שניתן לצפות בהיסטולוגיה. חסרון אפשרי של כל בדיקות stereological הוא הסובייקטיביות של החוקרים. לשם כך, באמצעות שני בוחנים עצמאיים שלנתח את כל הדגימות באופן עצמאי יכול לעזור כדי למנוע בעיה זו. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן נותן תובנה כמה דם יכול להגיע לממשק fetomaternal, זה עשוי להיות יתרון לשלב את זה עם complגישת ementary של בחינת הסכום הכולל של דם בכל זמן נתון בכלי הדם דרך הפלסטיק מטילה 16.
כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב שתי גישות עצמאיות. שינוי בכלי דם הוא ראשון להעריך כמותית ידי stereology והתוצאה מכן תוקף איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האמינות של התוצאות ניתן לחזק עוד יותר על ידי באופן אקראי, הדגימות. הדגימות מוכנות לפרוטוקול זה יכול לשמש בקלות גם לחקור פרמטרים אחרים של הריון כגון decidualisation, פיתוח כולל הלימפה mesometrial של הריון (MLAp) או immunodetection של תאים של עניין, כדי להעריך את הפנוטיפ הריון בקפדנות בmidgestation.
שיפוץ עורקים הוא שלב קריטי להריונות לא מסובכים בנשים וכישלון של שינויים אלה בבסיס התסמונות הגדולות יילוד (GOS), כלומר רעלת הריון, הגבלה בגדילת העובר ולידת עובר מת. אנו מציגים כאן טכניקות כדי להעריך פנוטיפ הריון במודלים של עכברים המחקים כמה מאפיינים של הפתופיזיולוגיה של GOS בזהירות.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
参考文献
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
