Оценка материнской сосудистого ремоделирования во время беременности в матке мышей

Все процедуры, описанные в этой рукописи в соответствии с правилами Британского МВД и утверждаются Группой Этическая экспертиза Кембридж. 1. Сбор образцов Настройка приурочен вязки, используя 8-12 недельных самок мышей C57BL / 6 с взрослыми мужчинами (до 2 самок в самцов) во второй половине дня. Проверьте наличие вагинальных пробок в знак совокупления рано утром на следующие дни. Наличие вилки в gd0.5 утром марок. На gd9.5, усыпить животное путем смещения шейных позвонков и вскрыть брюшную полость. Обратите внимание, что эвтаназию по CO 2 может привести к расширению сосудов. Используйте зубную нить осторожно перевязывать маточных артерий (рисунок 1, пунктирные стрелки). Tie нить вокруг артерий в конце каждого рога матки, проксимальнее яичников, а также вокруг шейки матки. Примечание: Не разорваться сосуды, так как это может привести к рухнула артерий. <Li> Рассеките матку быстро, используя рассечение ножницами, вырезая всю матку дистальнее трех точек лигирования на кончике рога матки и шейки матки. Поместите матки на подготовленную полистирола части таким образом, что оба рога выровнены вдоль той же продольной оси в противоположных направлениях от шейки. Аккуратно растянуть его и прикрепить на место, используя 2-3 25 G иглы. Погрузитесь полистирола в подготовленном 50 мл коническую трубку. Долить до 50 мл 10% формалина. Исправление для 5-6 ч при комнатной температуре. Отменить раствора формалина и заменить 50 мл 1х забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в течение 5 мин. Вырезания два рога матки проксимально к точке лигирования на каждом конце и проксимально к шейке в центре, обрезать любой лишний жир вокруг мест имплантации и мыть дважды в PBS в течение 5 мин, чтобы удалить следы формалина. Храните образцы в 70% этанола при 4 ° С (на срок до двух недель) до обработки. ВНИМАНИЕ: EthAnol является легковоспламеняющимся. Использование автоматизированной системы обработки с использованием параметров, указанных в таблице 1. Вставить рога индивидуально в парафин, чтобы они могли быть разрезают вдоль плоскости, перпендикулярной к продольной оси матки. Это гарантирует, что максимальная площадь каждого участка имплантации будет подвергаться для анализа в середине блока (фиг.2А). ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Это удобный момент времени для рандомизации блоков при желании. Использование микротома, сократить серийные срезы толщиной 7 мкм из блоков. Пятно один раздел на каждом интервале 49 мкм с гематоксилином и эозином (Н & Е, см раздел 2.1). Храните оставшиеся разделы при комнатной температуре SMA окрашивания и других последующих применений. Решение Время Температура 70% этанола 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С 100% этанол 1 час 40 ° С : 21px; "> Ксилол 1 час 40 ° С Ксилол 1 час 40 ° С Ксилол 1 час 40 ° С Парафин 1 час 63 ° C Парафин 1 час 63 ° C Парафин 1 час 63 ° C Парафин 1 час 63 ° C Таблица 1:. Настройки для автоматизированной обработки ткани Обзор установки для обработки ткани матки 2. Стерeological Оценка Н & Е окрашивание Deparaffinize разделы погружением слайдов, установленные в слайд стойку в 100% ксилола бане в течение 10 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: Ксилол легковоспламеняющимися и канцероген, что является токсичным при контакте и вдыхании. Эта работа должна быть проведена в вытяжном шкафу, используя средства индивидуальной защиты (СИЗ). Погрузитесь в ванну слайды, содержащие чистый ксилол для еще 10 мин. Последовательно погружают слайдов в ваннах, содержащих 100% этанола, 95% этанола, 70% этанола и очищенной воды в течение 5 мин каждый. Погружают слайдов в 50% Гилл № 3 гематоксилин раствора, разбавляют дистиллированной водой, в течение 5 мин. ВНИМАНИЕ: гематоксилин вредно при приеме внутрь и контакте с глазами. Носите соответствующую СИЗ при обращении. Промыть слайдов в окрашивании желоба под струей водопроводной воды в течение 10 мин. Погружают слайдов в 1% -ном растворе кислоты / спирта (1% 10 М соляной кислоты в 70% этаноле) в течение 10 секи мыть в корыте окрашивания под проточной водой. Погрузитесь слайдов в эозином решения в течение 30 сек и мыть в корыте под окрашивание проточной водопроводной водой в течение 10 мин. В вытяжном шкафу, последовательно погружают слайдов в ваннах, содержащих 70% этанола, 95% этанола и 100% этанола в течение 5 мин каждый. Погрузитесь слайдов в ванне, содержащей ксилол в течение 10 мин. Гора покровные с помощью ксилола на основе монтажа среду. Высушите по горизонтали и тщательно в вытяжном шкафу до визуализации слайды под микроскопом. Стереологический Оценка размера судна и реконструкции статусе Для каждого участка имплантации, определить, какие разделы рядом с среднесагиттальных точки. Хориоаллантоисной привязанность между плода и развивающейся плацентой служит хорошим индикатором среднесагиттальных точки. Выберите 3 секции на 49 мкм интервалы, близких к точке среднесагиттальных для анализа. Сканирование выбранных слайдов. Для того чтобы избежать IncЛУДИНГ вен, которые были показаны, чтобы быть более периферии расположены в имплантации сайтов 16, ограничение анализ на центральной 2/4 каждого сайта имплантации (рис 2А). Для оценки просвет размер, рисовать вокруг внутренней сосудов и записывать площадь этой формы. Для общего размера сосуда, рисовать вокруг внешней стенки сосуда, в том числе эндотелиальных клеток, перицитов и очный лейкоцитов. Примечание: отношение общего размера сосуда, чтобы просвет прокси для состояния реконструкции судна. В сосуды катушки через плоскость, что секция была разрезанной вдоль, может быть несколько поперечных сечений же артерии в одном слайде. Избегайте измерения тот же артерии несколько раз. Запишите измерения от 5 судов в каждом месте имплантации с крупнейшими и roundest люмен. Измерьте каждый сайт имплантации в трех экземплярах (три секции расположены 49 мкм друг от друга). Среднее из этих 15 измерений represeНочи средний диаметр крупнейших судов. Чтобы избежать перепредставленности крупных судов в некоторых образцах, измерения и то же число сосудов в каждой имплантации. 3. Качественная оценка с помощью иммуногистохимии Депарафинирование и Регидратация Deparaffinize разделы погружением слайдов, установленные в жаропрочную слайд стойку в 100% ксилола бане в течение 10 мин при комнатной температуре. Погрузитесь в ванну слайды, содержащие чистый ксилол для еще 10 мин. Последовательно погружают слайдов в ваннах, содержащих 100% этанола, 95% этанола и 70% и очищенную воду в течение 5 мин каждый. Антиген-поисковая Подготовка 10 мМ цитрата натрия буфере в очищенной воде и доведения рН до 6, использу 10 М соляной кислоты. Заполните жаропрочных контейнер, который может содержать 600 мл с 400 мл цитрат натрия буфера и место в отечественной скороварке, содержащей достаточное Ватэр, чтобы погрузить половина контейнера. Свободно приложите крышку скороварки и тепла до кипения. Место слайд стойку в буфер цитрата натрия и плотно закрепить крышку скороварки. После того, как под давлением, позволяют варить в течение 3 мин. Сбросьте давление в скороварку и выньте внутренний контейнер. Разрешить слайды для охлаждения в буфере цитрата натрия в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть скользит в ванне, содержащей очищенную воду в течение 5 мин. Окружите разделы, используя гидрофобный барьер перо. Вымойте слайды, погружая в PBS в течение 5 мин. Блокирование эндогенной пероксидазы и неспецифическое связывание Инкубировать срезы с 3% перекиси водорода, разбавленного в очищенной воде во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: Перекись водорода является очень раздражает глаза, кожу и при приеме внутрь. Носите соответствующую СИЗ. Нажмите лишнюю раствора перекиси водорода и промыть SLIдез дважды путем погружения в Трис-солевом буферном растворе (TBS) в течение 2 мин каждый. Инкубировать срезы с мышиного иммуноглобулина блокирования реагента от мыши на комплект мыши, подготовленный в соответствии с инструкциями изготовителя. Промыть слайды дважды в TBS в течение 2 мин каждый. Иммунологический гладкомышечных актина Подготовка антител решение разбавителя (представленную в комплекте) и инкубировать с разделами в течение 5 мин при комнатной температуре, или в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести 1: 100 мышиное анти-человеческий гладких мышц актина (DAKO M0851) в растворе антитела разбавителя. Развести мышиного IgG2a изотипа контроль антител в осаждающего раствора, обеспечивая, чтобы конечная концентрация иммуноглобулина эквивалентна в обоих растворах. Кран избыток раствора антитела разбавителя и крышки секции с либо разбавленных антител или изотипных решений управления. Инкубируют во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды дважды в TBS для2 мин каждый. Развести биотинилированного анти-мыши вторичного антитела и инкубируют секции в течение 10 мин при комнатной температуре, или в соответствии с инструкциями производителя. Промыть скользит по одному разу TBS и PBS в течение 2 мин, соответственно. Подготовьте 3,3-диаминобензидин (DAB) решение в соответствии с инструкциями изготовителя. Обложка секции с раствором DAB и инкубировать в течение 4 мин, обеспечивая следить разделы, чтобы избежать развития избыточного цвета. ВНИМАНИЕ: DAB легковоспламеняющимися и канцероген, что является токсичным при контакте и вдыхании. Носите соответствующую СИЗ при обращении. Погружают слайдов в очищенной воде, как только желаемый интенсивность окраски достигается. Контрастное 50% Гилл № 3 гематоксилином в течение 20 сек и мыть в корыте под окрашивание проточной водой, пока вода не станет чистой. Обезвоживание и монтаж В вытяжном шкафу, последовательно погружают в ванны слайды, содержащие 70% ETHAnol, 95% этанола и 100% этанола в течение 5 мин каждый. Погрузитесь слайдов в ванне, содержащей ксилол в течение 10 мин. Гора покровные с помощью ксилола на основе монтажа среду. Высушите по горизонтали и тщательно в вытяжном шкафу до визуализации слайды под микроскопом